转座子作为生物体中能够独立移动的特异DNA序列元件,是自然界中最丰富的基因种类之一,转座子的存在与活动使基因组并不是一个静止的组合,而是一个不断改变自身构造的动态机体,在进化、个体差异和生物多样性的保持中发挥了至关重要的作用。然而,转座子的过度活跃也会引起基因组的紊乱,从而导致过量突变和各类疾病的发生,因此,机体进化出了一种新的机制—piRNA来平衡基因组的动态变化。研究转座子与piRNA之间的动态平衡机制,对解开进化的神秘面纱和遗传变异的分子基础,具有重要的意义。家蚕的性别决定为ZW型,具有强雌决定作用的W染色体可以转录产生大量的piRNA,是研究转座子与piRNA相互作用的理想研究模型。本研究通过调查家蚕W和Z染色体上外源piggyBac转座子的转座活性,结合多层面转录组学的方法,揭示了转座子活性与piRNA表达量之间的关系,所获得的的主要结果和结论如下：1、Z染色体单拷贝转基因品系的建立在本实验室前期研究中,我们已经获得了两个插入位点位于w染色体的转基因品系,分别命名为TG-W1和TG-W2。为了探究Z染色体上的转基因的稳定性是否受到其piRNA的影响,我们从100多个转基因品系中,筛选获得了1个插入位点在Z染色体上的转基因品系,命名为TG-Z。将TG-Z转基因家蚕(♀)与野生型家蚕(♂)杂交,F1代个体中雄性家蚕的复眼和神经中均能观察到绿色荧光,雌性家蚕没有荧光。将获得TG-Z品系与野生型经过5代杂交,后代结果都是雄性有绿色荧光,雌性无荧光表达。为了确认该品系中绿色荧光转基因载体的插入位点,对该家蚕个体进行了反向PCR,结果显示转基因载体的插入位点是位于1号染色体上11.5Mb处,遗传连锁位置为23.7cM。2、piggyBac转座-子在Z和W染色体上的稳定性为了检测piggyBac转座子在转基因家蚕中的再转座活性,我们发明了利用性染色体连锁和稳定表达外源转座酶的策略。由于W染色体只存在于雌蚕中,因此W连锁的转基因只在雌性个体中能检测到转基因标记；Z染色体在雌蚕中只有—条,因此子代的Z连锁的雌蚕与非转基因雄蚕的子代个体中只有雄性个体中能检测到转基因标记。我们将TG-W1、TG-W2和TG-Z的雌性家蚕分别与在家蚕全身表达转座酶的稳定转基因品系TG-R雄性家蚕杂交,得到的后代命名为T-W1\W2\Z-R;将F1代中同时含有绿色和红色荧光的个体与野生型家蚕杂交,根据后代的荧光表达数目,计算piggyBac的再转座率。结果显示,piggyBac在TG-W1品系中的再转座效率为2.77%；在TG-W2中为5.68%；在TG-Z中为16.73%。表明piggyBac在W染色体上的再转座效率要显著低于Z染色体。3、不同转基因品系中的差异表达基因分析为了探究piggyBac转座子在三个转基因品系间的再转座率差异大的分子机理,我们提取了不同个体的卵巢和大脑组织RNA,进行了转录组测序分析。提取的样品浓度均在200ng\μL以上,将提取的组织RNA进行安捷伦检测,RNA的完整度(RNA Integrity Number)均在6.0以上。对转录组数据进行基因差异表达分析(DEGs)、GO功能显著性富集分析、Pathway显著性富集分析三方面的数据分析,不同的转基因个体间基因差异表达比较大,GO注释分成了三类：基因的分子功能(molecular function)、细胞成分(cellular component)、参与的生物过程(biological process),在不同的功能层面均有不同的基因注释。Pathway主要将差异基因富集到细胞过程、环境信息加工、遗传信息加工、新陈代谢以及生物体系统通路。虽然我们鉴定到了较多的差异表达基因,但是对这些基因的深入分析并没有发现其与转座子活性有直接的关系,我们推测这些差异可能是由于不同转基因的插入位点不一样而引起的变化。4、不同转基因品系small RNA的鉴定与分析从转录组数据的分析结果,我们推测piggyBac在不同染色体转座效率的不同不是由特定基因的表达差异引起的,加之越来越多的线索表明转座子的活性可能与piRNA的表达有较大的关系,因此,我们对不同转基因品系的卵巢和脑组织进行了小RNA测序和分析。对miRNA也是做了与转录组数据同样的三个方面的分析,没有发现显著的差异,暗示miRNA与转座子的转座活性也没有直接的相关性；通过借助文献中对piRNA分析的方法,发现大脑中的差异转座子表达量明显低于卵巢转座子差异表达,而且卵巢中的piRNA表达量大约有76%,大脑中的piRNA表达量大约有24%。将piRNA与转基因载体及其插入位点上下游序列比对,结果表明TG-W1\W2\Z卵巢比对上的piRNA数量大于大脑中比对上的数量,同时也发现卵巢中转基因插入位点的两侧具有高量的piRNA富集,其中TG-Z插入位点附近中piRNA的数量显著低于TG-W1\W2中piRNA的数量。这一结果暗示,piggyBac转座子在w和z染色体上再转座效率的差异可能是由于插入位点附近piRNA含量的差异导致的。综上所述,本论文通过转基因、遗传学分析、转录组分析和小RNA测序,首次揭示了piggyBac这一广泛应用于动植物转基因的转座子的转座效率与piRNA之间的关系。这一研究结果,不但为转座子的基础研究和piRNA的作用机制研究提供重要的参考,也可能为转基因的稳定性和安全性研究奠定了重要的基础。