L-苯丙氨酸在食品、医药等领域具有广泛的应用和巨大的市场价值。因此,有关提高L-苯丙氨酸工业化生产的研究手段也受到了广泛关注和深入研发。微生物发酵法作为目前工业化生产L-苯丙氨酸的主要手段,具有低成本、高效率等优点。传统的微生物发酵法主要依靠诱变筛选或者携带质粒来获得具有优良性状的生产菌株。但以上方法不仅效率低,而且很难获得具有稳定遗传特性的生产菌株。鉴于此,本研究采用了基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑技术从基因水平上对一株已经具备高效生产性能的L-苯丙氨酸工程菌株E.coli PHE13的代谢途径进行系统代谢改造,最终获得了一株转化率更高且遗传稳定的L-苯丙氨酸工程菌株PHE28。具体工作如下:首先,本研究用强启动子Ptrc分别对莽草酸激酶同工酶和莽草酸脱氢酶同工酶进行了过表达,并从中筛选出了效果更显著的莽草酸激酶I表达基因aro K以及莽草酸脱氢酶基因ydi B。摇瓶结果显示,整合了Ptrc-aro K与Ptrc-ydi B的菌株PHE16产量为23.9g/L,相比出发菌株PHE13提高了12.7%。这表明进一步提高莽草酸途径通量对L-苯丙氨酸的合成具有促进作用。随后,为了提高前体物PEP的供应,本研究将菌株自身PTS系统中的酶IIBC编码基因pts G进行了敲除,并用不同强度的启动子对半乳糖苷透过酶与葡萄糖激酶进行过表达,构建了不依赖PEP的糖摄取途径。摇瓶结果显示,替换了PTS系统的菌株在产量和转化率上均未超过对照菌株PHE16,表明单独修饰PTS系统不能提高L-苯丙氨酸的积累。为了提高前体物E4P的供应,本研究引入了来自青春双歧杆菌的磷酸转酮酶基因xfp K并用强启动子Ptrc进行过表达。摇瓶结果显示,构建成功的菌株PHE23的L-苯丙氨酸产量和转化率分别为26.2 g/L和24%,相比于对照菌株PHE16提升了4.8%和1.1%。但同时,其乙酸积累量达到了4.9 g/L,比对照菌株PHE16提高了53.1%。该结果表明,xfp K基因的引入虽然对L-苯丙氨酸的合成有促进作用,但促进生产E4P的同时也会生成乙酰磷酸,从而增加了乙酸的积累。考虑到高浓度乙酸对菌株的生长和代谢带来的负面影响,本研究在菌株PHE23的基础上,将乙酸直接合成的关键酶基因ack A、tdc D、pox B进行了逐一敲除,以探究这些基因敲除后对乙酸积累和L-苯丙氨酸生产的影响。摇瓶结果显示,敲除了ack A、tdc D、pox B基因的菌株PHE26的乙酸积累量最少且产量最高,乙酸积累量和L-苯丙氨酸产量分别为1.6 g/L和28.1 g/L。在此基础上,为了进一步降低乙酸合成,研究中将乙酰磷酸转移酶基因pta进行了敲除。摇瓶结果显示,菌株PHE27的乙酸积累量降低到了1.2 g/L,L-苯丙氨酸产量和转化率分别提高至28.5 g/L和25.6%。说明乙酸合成途径相关基因敲除对于降低乙酸积累具有显著效果,同时有助于L-苯丙氨酸的合成。为将PEP节点的碳流引向莽草酸途径同时减少中心代谢途径的代谢流溢流,本研究引入了一段已解除反馈抑制的aro G（F146R）基因序列。摇瓶显示,改造菌株PHE28的产量和转化率分别为29.3 g/L和26.9%。表明该基因的引入有助于L-苯丙氨酸的生产。最后,利用5 L发酵罐对菌株PHE28进行发酵性能测试。结果显示,在48 h发酵后,该菌株对L-苯丙氨酸的产量为82 g/L,平均生产强度为1.7 g/L/h,转化率为28%,相比于出发菌株提高了4%。说明该菌株已具备良好的工业化潜力。另外,本研究中所采用的代谢工程改造策略可以推广到其它芳香族氨基酸及衍生物生产菌株的构建当中。