论文部分内容阅读
以不产氧光合细菌（ABP）作为模型的光合机构和光能转换机制已有深入研究和认识,外周捕光复合体（LH2）执行光能的吸收与传递作用,在调节光合效率方面起着不可替代的作用。LH2具有丰富的多样性,基因组、转录组和蛋白质水平的分析显示,多拷贝puc BA在不产氧光合细菌中普遍存在,只有单个基因表达的现象很少见。尤其是一些菌株在不同的光环境中形成不同光谱类型的LH2,其原因是形成LH2αβ亚基的基因（puc BA）在不同环境中表达,组装形成不同的LH2。多拷贝基因中有一些puc BA并不表达,如沼泽红假单胞菌CGA009菌株的puc BAe,这些基因的功能尚不清楚。由于多拷贝基因的同时表达,组装形成源于不同的puc BA基因LH2,这也是LH2难以高度纯化和获得高度有序晶体的主要原因。如何获得多拷贝puc BA编码LH2高度纯化产物是解决上述这些问题的关键。本课题组前期成功获得了敲除5拷贝puc BA缺失突变株CGA009（?puc BA）,本文以该缺失突变株为表达宿主,以穿梭质粒p BBR1MCS2为表达载体,以红色荧光蛋白基因（rfp）和puc BAd基因作为报告基因,对p BBR1MCS2进行表达元件改造,以期建立不产氧光合细菌LH2高效表达体系,为获得高纯度具有功能性的LH2用于其结构和功能关系的研究奠定基础。主要研究结果如下:（1）pBBR1MCS2表达载体的遗传改造。在载体上依次插入T7-RNA聚合酶基因（T7pol）、T3终止子、T7终止子,在E.coli DH5α表达,通过报告基因（rfp）表达的检测,得到了高效表达rfp基因的载体p BBR1MCS2-PT7-puc BAd-rfp-T7Ter-T3-T7pol-T3Ter（p BR-PT7-T7pol）。将其导入CGA009（?puc BA）,得到rfp基因表达的重组子。与CGA009（?puc BA）相比,在高低光强下,重组子的生长速率、活细胞和菌体蛋白抽提液的近红外区吸收光谱、光合色素含量无明显差异（P＞0.05）,puc BAd编码产物（LH4）未见明显表达。其原因可能是重组子的表达量较低,因此进一步对p BR-PT7-T7pol进行了优化。（2）启动子的筛选。用Ppck A（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因启动子）、Pbad R（苯甲酸脂降解酶基因启动子）和Pars（砷抗性基因启动子）替换p BR-PT7-T7pol上的T7启动子,分别导入E.coli DH5α,RFP荧光信号检测表明,这3个启动子活性均显著升高（P＜0.05）,由高到低为:Ppck A、Pars、Pbad R。此外,对实验室前期构建的载体p UC19-Pars-gfp-ars R进行改造,得到重组载体p UC19-Pars-gfp-ars R-puc BAd（p19-puc BAd）,GFP荧光信号也较高。（3）LH2表达载体的构建。将这4个启动子活性较高的载体分别导入CGA009（?puc BA）,报告基因荧光信号都很强,表明这4个载体均能在CGA009中高效表达。其中含有p BR-Ppck A载体的重组子与CGA009（?puc BA）相比,其生长速率、菌体蛋白提取液的吸收光谱有明显提高（P＜0.05）,表明p BR-Ppck A对puc BAd的表达效果较好,OD806:OD860为0.86,比对照菌株升高了0.24,表明puc BAd的产物（LH4）有所表达,经过分离纯化,得到puc BAd的表达产物LH4（简称LH2-D）,与预期结果一致。并利用puc BAa验证了该表达体系的可行性,表明puc BAa表达形成LH2（简称LH2-A）。（4）基因缺失突变株的puc BAb基因组回补。利用同源臂重组的方法,将puc BAb原位回补,得到回补突变株Δpuc BA::puc BAb,经过分离纯化,得到puc BAb的表达产物LH2（简称LH2-B）,表明基因组也能作为表达系统开展多拷贝puc BA基因的研究。（5）LH2光谱特征分析。对纯化的3种单一puc BA表达的LH2与野生菌株（CGA009）LH2（简称LH2-WT）进行紫外可见光吸收光谱和荧光光谱分析。紫外可见光吸收光谱分析表明,LH2-WT、LH2-B、LH2-A呈现典型LH2的BChl a Qy带（803和856 nm）特征峰,803与856nm峰值比值从大到小为LH2-WT＞LH2-B＞LH2-A,表明杂合的LH2-WT具有更高的光吸收能力。LH2-D呈现LH4的BChl a Qy带（only-803 nm）特征峰,且4种LH2中LH2-D在803nm处的峰值最大,表明LH2-D在803nm处光吸收能力最大,利于菌体获得更多的能量。荧光光谱分析发现,4种LH2在λem=863nm时激发光谱与吸收光谱结果趋向一致,而发射光谱分析发现,4种LH2最大发射峰位均在863nm,峰值从大到小为LH2-WT＞LH2-B＞LH2-D＞LH2-A。BChl:Car约为3:1。Car到BChl分子内能量传递效率从大到小为LH2-WT＞LH2-B＞LH2-D＞LH2-A,该结果与发射光谱分析结果趋向一致。综上所述,本研究构建了2种单一puc BA表达体系。通过吸收光谱可检测到puc BA基因的产物（LH2）表达,经过分离纯化可以得到单一puc BA基因表达的LH2。本研究为探索不产氧光合细菌多拷贝puc BA基因遗传表达体系的建立奠定了基础。