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背景:胰腺导管腺癌(PDAC)是全世界高致死性恶性肿瘤,其临床表现隐匿、病情进展迅速以及对治疗手段的严重抵抗,导致其死亡率居高不下。胰腺癌是高侵袭性肿瘤,几乎90%的胰腺癌患者都存在着转移,而胰腺炎症的存在为胰腺癌的浸润和转移提供了有利的环境。胰腺炎中的炎症细胞及炎症介质所形成的炎症微环境,通过激活炎症信号NF-kB、STAT3、COX-2等促进胰腺癌的生长、侵袭及远处转移。成纤维细胞生长因子21(FGF21)属于FGF家族非典型成员,本课题组前期研究发现,正常胰腺腺泡细胞中FGF21呈高表达水平,而在胰腺导管腺癌组织中表达却明显受抑;因此,我们推测FGF21可能参与了胰腺癌的发生和发展过程。随后,我们查阅文献发现许多报道称,当多种损伤因子作用小鼠腺泡细胞时,胰腺组织的FGF21能迅速升高,并能通过抑制胰腺组织中炎症因子的产生及炎症信号的激活,从而减轻腺泡细胞的炎症损伤。换言之,正常胰腺组织中高表达水平的FGF21能在炎症环境下进一步升高并抑制胰腺炎症,而在胰腺癌中FGF21的表达却很低,我们推测胰腺癌中FGF21的低表达可能失去了其对炎症损伤的抑制作用,从而促进胰腺癌细胞生长、迁移、侵袭和转移等恶性生物学行为。那么,如果外源性提高胰腺癌FGF21水平就可能通过抑制胰腺癌的炎症微环境,从而抑制胰腺癌的进展。目的:为了验证我们的推测,我们首先通过外源性给予FGF21初步探讨其能否抑制炎症环境下胰腺癌细胞的迁移和侵袭行为;其次,我们进一步探讨了FGF21抑制胰腺癌细胞迁移和侵袭可能的分子机制,希望能对胰腺癌的治疗提供一种新的思路。方法:本研究分为两部分:1.FGF21对炎症环境下人胰腺癌细胞迁移和侵袭的抑制作用(1)人胰腺癌细胞Capan-1、AsPC-1的炎症环境的构建通过qRT-PCR分别检测Capan-1、AsPC-1细胞中不同浓度脂多糖(LPS)作用下IL-6 mRNA的转录情况,以筛选LPS的最佳作用浓度。(2)FGF21对人胰腺癌细胞Capan-1、AsPC-1迁移及侵袭的影响1)通过划痕实验观察FGF21对炎症环境下人胰腺癌细胞Capan-1、AsPC-1的迁移情况,并筛选出最佳FGF21作用浓度。用脂多糖和不同浓度FGF21分别处理Capan-1、AsPC-1细胞,实验分组如下:Control组、FGF21(1ug/ml)组、LPS组、FGF21(1ug/ml)+LPS组、FGF21(2ug/ml)组+LPS组、FGF21(4ug/ml)组+LPS组。根据划痕实验结果筛选出FGF21作用浓度。2)通过Transwell实验检测FGF21对炎症环境下人胰腺癌细胞Capan-1、AsPC-1迁移的影响。实验分组为Control组、FGF21组、LPS组、FGF21+LPS组。3)通过Transwell实验检测FGF21对炎症环境下人胰腺癌细胞Capan-1、AsPC-1侵袭的影响。实验分组为Control组、FGF21组、LPS组、FGF21+LPS组。2.FGF21抑制炎症环境下人胰腺癌细胞Capan-1、AsPC-1迁移和侵袭的分子机制(1)FGF21对人胰腺癌细胞Capan-1、AsPC-1中AMPK/NF-kB信号通路的激活情况。(实验分组:Control组、FGF21组、LPS组、FGF21+LPS组)1)通过Western Blot检测各组细胞中P-AMPK、AMPK、P-P65、P65的蛋白表达情况。2)通过免疫荧光检测各组细胞中NF-kB P65入核情况。3)通过qRT-PCR检测各组细胞中MMP9、IL-6 mRNA的转录情况。4)通过Western Blot检测各组细胞中MMP9的蛋白表达情况。(2)加入AMPK抑制剂(Compound C)后,FGF21对炎症环境下胰腺癌细胞Capan-1、AsPC-1中AMPK/NF-kB信号通路的激活情况。(实验分组:LPS组,FGF21_+LPS组,FGF21+LPS+Compound C组)1)通过Western blot检测各组细胞中P-AMPK、AMPK、P-P65、P65蛋白表达情况。2)通过免疫荧光检测各组细胞中NF-kB P65入核情况。3)通过qRT-PCR检测各组细胞中MMP9、IL-6 mRNA的转录情况。4)通过Western Blot检测各组细胞中MMP9的蛋白表达情况。结果:1.FGF21抑制炎症环境下人胰腺癌细胞Capan-1、AsPC-1的迁移和侵袭(1)人胰腺癌细胞Capan-1、AsPC-1的炎症环境的构建qRT-PCR结果显示:随着LPS浓度增高,Capan-1和AsPC-1细胞株中IL-6 mRNA的表达情况均随之递增(P<0.05)。(2)FGF21对人胰腺癌细胞Capan-1、AsPC-1迁移及侵袭的影响1)划痕实验结果可见:LPS组中Capan-1、AsPC-1细胞株的迁移率均明显高于Control组和FGF21组,而FGF21处理后迁移率明显降低,且随着FGF21的浓度增加,抑制迁移的效果逐渐增强(P<0.05),Control组与FGF21组之间的迁移率差异无统计学意义(P>0.05)。2)Transwell迁移实验结果可见:与划痕实验结果一致,LPS组中Capan-1、AsPC-1细胞株的细胞迁移率均明显高于Control组和FGF21组,而FGF21+LPS组较LPS组迁移率明显降低(P<0.05),Control组与FGF21组之间的细胞迁移率无统计学意义(P>0.05)。3)Transwell侵袭实验结果与Transwell迁移实验趋势一致,LPS组中Capan-1、AsPC-1细胞株的细胞侵袭率均明显高于Control组和FGF21组,而FGF21+LPS组较LPS组侵袭率明显降低(P<0.05),Control组与FGF21组之间的细胞迁移率无统计学意义(P>0.05)。2.FGF21抑制炎症环境下人胰腺癌细胞Capan-1、AsPC-1迁移和侵袭能力的机制(1)FGF21对人胰腺癌细胞Capan-1、AsPC-1中AMPK/NF-kB信号通路的激活情况1)Western blot结果显示:LPS组与Control组中P-AMPK的蛋白表达均低,而FGF21组及FGF21+LPS组中P-AMPK明显升高。Control组和FGF21组之间P-P65表达无明显差异,而LPS组较Control组P-P65的蛋白表达明显增高,而FGF21+LPS组P-P65的蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),AMPK和P65在各组细胞中表达无明显差异(P>0.05)。2)免疫荧光结果显示:LPS组NF-kB P65入核明显增强,FGF21处理之后P65入核情况明显受抑。3)qRT-PCR结果显示:LPS组中MMP9和IL-6 mRNA转录增加,FGF21+LPS组MMP9和IL-6的mRNA转录降低,差异有统计学意义(P<0.05),FGF21单独处理组与Control组之间差异无统计学意义(P>0.05)。4)Western blot结果显示:与Control组和FGF21组相比,LPS组的MMP9蛋白表达增多,FGF21处理后MMP9蛋白表达受到抑制,差异有统计学意义(P<0.05),FGF21单独处理组与Control组无明显差异(P>0.05)。(2)加入AMPK抑制剂后,FGF21对人胰腺癌细胞Capan-1、AsPC-1中AMPK/NF-KB信号通路的激活情况1)Western blot结果显示:与FGF21+LPS组相比,FGF21+LPS+Compound C组P-AMPK的蛋白表达降低,而P-P65的蛋白表达增高(P<0.05),AMPK和P65蛋白在各组中表达无明显差异(P>0.05)。2)免疫荧光结果显示:LPS组P65入核较多,给予FGF21处理后P65入核减少,而FGF21+LPS+Compound C组P65入核情况再次增多。3)qRT-PCR结果显示:与FGF21+LPS组对比,FGF21+LPS+CompoundC组中MMP9和IL-6 mRNA转录增加,差异有统计学意义(P<0.05)。4)Western blot结果显示:与FGF21+LPS组对比,FGF21+LPS+Compound C组的MMP9蛋白表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:FGF21可抑制炎症环境下人胰腺癌细胞株Capan-1、AsPC-1的迁移和侵袭,其可能分子机制是通过激活AMPK,抑制NF-kB,进而抑制胰腺癌细胞MMP9、IL-6的转录和表达。FGF21在炎症环境下胰腺癌的进展中扮演着重要的角色,详细机制还有待进一步研究。