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中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)对中华蜜蜂(Apiscerana,简称中蜂)造成了严重的威胁,能引起中蜂群体性崩溃。目前的防控措施包括加强饲养管理,选育抗病品种,使用药物防治等。但是,目前这些方法无法有效控制中蜂囊状幼虫病,特别是药物防治导致蜂产品的污染和蜜蜂抗药性问题。研制中蜂囊状幼虫病防治新技术刻不容缓。RNA干扰方法是很有潜力的病毒防治方法。本论文主要利用RNA干扰方法沉默CSBV的基因和中蜂体内抗CSBV相关的基因,拟建立防治中蜂囊状病的新方法。
本论文首先根据CSBV的Vp1和Sbv1基因序列设计dsRNA片段,通过喂食的方法导入中蜂2龄幼虫体内,然后通过实时定量PCR(quantitativereal-time PCR,qRT-PCR)和northern blot方法检测基因沉默情况。qRT-PCR分析饲喂dsRNA72 h的中蜂幼虫中CSBV基因的转录情况发现,dsSbvl和dsVp1处理的幼虫中CSBV的相应基因(Sbv1和Vp1)转录显著减少,相对于仅喂食CSBV或dsGfp+CSBV的处理组来说减少了80-95％；同时,喂食dsRNA显著减少了中蜂幼虫的死亡率,与仅喂食CSBV的处理组相比减少了35％-40％；northern blot分析也发现,dsRNA喂食的幼虫体内出现21到24 bp长的小RNA片段(sirNA),表明RNAi相关的途径是通过喂食的dsRNA激发的,是导致CSBV的沉默的因为。
论文还利用RNAi方法沉默业已筛选的与病毒感染相关的中蜂幼虫基因(Ago,Eif和Hex110),试图证明这些基因的抗病毒功能。实验结果表明,尽管喂食这三个基因dsRNA未能有效减少感染CSBV的中蜂2龄幼虫的死亡率,但是qRT-PCR检测发现,饲喂dsEif72 h后的中蜂幼虫中Eif基因的转录显著降低,相对于仅喂食CSBV的幼虫降低了66％；相对于仅喂食CSBV的中蜂幼虫,喂食dsEif和CSBV的幼虫中CSBV的转录水平显著升高了16％。
本论文结果证明,喂食CSBV柏关的dsRNA片段能够保护中蜂抵抗CSBV的感染；同时,沉默中蜂体内与CSBV感染有关的Eif基因,有利于中蜂幼虫体内的CSBV的转录,说明这一基因可能与中蜂抗病毒有关。这些结果为进一步利用RNA干扰的方法防治中蜂囊状幼虫病提供了思路。