【摘 要】
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[目 的]男性不育是一类复杂的疾病,致病因素众多,诊断困难。越来越多的证据表明表观遗传与男性不育相关。其中DNA甲基化是研究最广泛的表观遗传修饰方式,包括印记基因在内的特异性位点甲基化以及全基因组甲基化,均与男性不育存在相关性。然而精子是一类异质性很高的特化细胞,一份精液中只有少数精子具备受精卵子的能力。以总体精子样本为对象研究精子DNA甲基化与受精之间关系受精子异质性影响较大。与卵母细胞透明带结
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[目 的]男性不育是一类复杂的疾病,致病因素众多,诊断困难。越来越多的证据表明表观遗传与男性不育相关。其中DNA甲基化是研究最广泛的表观遗传修饰方式,包括印记基因在内的特异性位点甲基化以及全基因组甲基化,均与男性不育存在相关性。然而精子是一类异质性很高的特化细胞,一份精液中只有少数精子具备受精卵子的能力。以总体精子样本为对象研究精子DNA甲基化与受精之间关系受精子异质性影响较大。与卵母细胞透明带结合的精子具有正常形态和核DNA、以及更好的受精潜能,是研究正常功能精子的理想样本。本研究拟通过单细胞甲基化组测序技术,比较透明带结合精子和未筛选精子DNA甲基化组差异,探讨样本内精子甲基化差异对受精能力的影响,筛选与男性不育相关的DNA甲基化位点、基因和通路。[方 法]本实验纳入4名男性患者,取精后通过密度梯度离心法优选精子。处理后精子再通过透明结合实验筛选透明带结合精子为实验组,未筛选精子为对照组。使用单细胞全基因组重亚硫酸盐法进行甲基化测序,通过生物信息学分析,筛选两组间差异甲基化位点（DMC）、差异甲基化区域（DMR）并确定差异甲基化基因;通过GO分析差异甲基化区域对分子功能、细胞组分和生物过程富集基因功能。[结 果]测序发现CpG覆盖率为45.56-48.62%,透明带结合精子DNA总体甲基化水平显著低于未筛选精子（45.9±0.68%vs 48.2±0.24%,P<0.01）。两组间共有11175个DMR,其中1429个DMR位于启动子区域。通过对启动子包含DMR的基因进行GO分析,富集程度>2分子功能有3个:细胞骨架结合、细胞粘附结合和蛋白激酶结合,均参与了精子发生和受精的多个过程。在这3类分子功能中富集的基因共有155个,在已知功能的基因中有42个基因分别参与了精子发生、精子形态发生、精子获能、顶体反应和精卵结合。对91个印记基因甲基化状态进行分析,发现20个印记基因存在DMR,且父源印记基因甲基化异常率高于母源印记基因（48.3%vs 9.8%,P<0.001）。通过IGV（Integrative Genomics Viewer）分析发现,实验组父源印记基因H19 ICR1的甲基化有升高的趋势,但无显著差异（95.0±2.2%vs 89.9±4.8%,P>0.05）,母源印记基因MEST甲基化在两组间无显著差异（3.4±1.7%和2.4±1.3%,P>0.05）。[结 论]在同一份精液中,透明带结合精子具有更低的全基因组甲基化水平,透明带结合精子与未筛选精子间存在众多差异甲基化位点和不同的基因调控模式。精子中与细胞骨架、细胞粘附和蛋白激酶功能相关的基因甲基化异常可能影响精子活动力、形态以及精子获能、顶体反应和精子结合等过程,进而影响精子与透明带结合能力和受精能力。本研究筛选出155个影响精子受精能力的备选基因,为下一步深入探讨受精机制和筛选男性不育的预测指标打下了良好基础。
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