神经前体细胞（NPCs）是具有自我更新和多向分化能力的原始神经细胞，其多向分化能力即在特定因素诱导下能向神经元和胶质细胞分化。将NPCs用于神经系统退行性疾病如帕金森病（PD）的细胞移植治疗具有应用前景。对此目前有三种策略：（1）注射神经营养因子或生长因子诱导脑内NPCs向损伤部位迁徙、分化。（2）将原代培养或永生化的NPCs移植到相应脑区，在体内相应微环境作用下分化为具有特定功能的神经元。然而，这种植入的NPCs很少能够定向分化为多巴胺（DA）能神经元，大多数移植细胞分化为胶质细胞。（3）将原代培养或永生化神经干细胞体外诱导分化为特定的DA能神经元，然后移植到相应脑区发挥治疗效果。已有研究发现，经移植诱导分化DA能神经元的PD模型大鼠行为有显著改善。　　 实验证实，将来自睾丸的Sertoli细胞与其它组织来源细胞共培养可以影响这些细胞的生长、发育和分化。但Sertoli细胞表达的特定因子尤其是DHH的诱导作用还未见报道。为此，本博士学位论文拟以Sertoli细胞表达的DHH因为切入点，深入探讨Sertoli细胞是否能促进神经前体细胞分化的可能性。　　 本博士学位论文涉及的研究内容主要包括三部分：　　 第一部分：Sertoli细胞对大鼠胚胎中脑NPCs的营养及促分化作用　　 目的：研究Sertoli细胞对胚胎中脑NPCs的营养及向DA能神经元分化的诱导作用。　　 方法：将大鼠Sertoli细胞与胚胎13.5天大鼠中脑NPCs体外接触共培养和非接触共培养10天，免疫荧光检测DA能神经元标记物酪氨酸羟化酶（TH）的表达情况。　　 结果：接触共培养和非接触共培养10天时TH阳性的神经元分别为30.56±7.08，26.45±6.23。而对照NPCs单独培养组仅为1.12±0.06。　　 结论：Sertoli细胞能够促进与其共培养的胚胎中脑NPCs定向分化为DA能神经元。　　 第二部分：大鼠DHH基因克隆及其在条件细胞COS7、NIH/3T3、9L、星形胶质细胞和Sertoli细胞及上清中的表达与过表达　　 目的：从SD大鼠睾丸组织中克隆DHH基因，构建真核表达载体pLXSN/DHH：感染条件细胞COS7、NIH/3T3、9L、星形胶质细胞和Sertoli细胞，用免疫荧光细胞化学、实-时定量PCR、Western Blot等方法鉴定DHH在上述细胞及上清中的表达与过表达。　　 方法：　　 1.DHHcDNA的克隆：取大鼠睾丸组织，Trizol一步法提取总RNA。甲醛变性琼脂糖凝胶电泳证实所提RNA没有明显降解后，SuperscriptⅡ逆转录酶作用下进行逆转录反应。用T4DAN连接酶将其连于pGEM T Easy载体，转化DH-5α感受态菌，挑取白色菌落筛选重组质粒，酶切鉴定后送大连宝生物有限公司测序。　　 2.DHH真核表达载体的构建：分别提取质粒pGEM T Easy/DHH、pLXSN、用限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切，电泳分离，玻璃奶纯化回收DHH片段和线性质粒pLXSN，T4DAN连接酶连接两片段，连接产物转化DH-5α，小量提取质粒，限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ酶切鉴定后大量提取。　　 3.脂质体LipofectamineTM转染PT67细胞及DHH在条件细胞中的表达：当PT67细胞融合度达到70～80％时，将真核表达载体pLXSN/DHH-LipofectamineTM复合物加入其中，经G418筛选。免疫细胞化学的方法证实外源基因在包装细胞系中的表达。待细胞增殖后传代，培养36～40h后收集上清并感染条件细胞COS7、NIH/3T3、9L、星形胶质细胞和Sertoli细胞，G418筛选单克隆扩增培养。用免疫荧光、实-时定量PCR、Western Blot等方法鉴定DHH在上述细胞中的表达并能分泌到培养上清中。　　 结果：　　 1.DHHcDNA的克隆及真核表达载体的构建：所提RNA通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳观察RNA的带型估计mRNA的完整性。清楚看到28S、18S和5SRNA带型。用RT-PCR扩增得到预期的cDNA片段，其大小为1220bp。PCR产物加尾后克隆于pGEMT-Easy载体，用EcoRⅠ和BamHⅠ进行初步酶切鉴定，有1220bp片段插入的克隆继续以载体上的酶和片断内部的酶进行酶切、测序，结果证实插入片段为DHHcDNA，其序列与GenBank（XM_343327）报道的一致。回收测序正确质粒pGEM T Easy/DHH的插入片段，与经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切的线性pLXSN质粒片段连接。转化细菌，小提质粒，用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，有1200bp左右的条带，说明pLXSN/DHH载体构建成功。　　 2.DHH在条件细胞及培养上清中的表达：免疫细胞化学的方法证实外源基因DHH能在PT67包装细胞系中表达；所收集病毒上清感染条件细胞COS7、HIN/3T3、9L、星形胶质细胞和Sertoli细胞，经免疫荧光、实-时定量PCR、Western Blot等方法鉴定后均可见DHH在上述细胞中的高表达并能分泌到培养上中清。　　 结论：成功构建了真核表达载体pLXSN/DHH。DHH能在条件细胞中高表达并可分泌到培养上清中，具有良好的生物活性。　　 第三部分：对Desert Hedgehog（DHH）诱导大鼠胚胎中脑神经前体细胞（NPCs）定向分化能力的探讨　　 目的研究Desert Hedgehog（DHH）对胚胎中脑神经前体细胞（NPCs）向多巴胺能神经元分化的诱导作用　　 方法：将实验分为四大组：（一）成功表达DHH的条件细胞COS7、NIH/3T3和9L分别与胚胎中脑神经前体细胞（NPCs）接触共培养和非接触共培养；（二）正常纹状体来源的星形胶质细胞和成功表达DHH的星形胶质细胞分别与胚胎中脑神经前体细胞（NPCs）接触共培养和非接触共培养；（三）Sertoli细胞过表达DHH与阻断DHH发挥作用，分别与胚胎中脑神经前体细胞（NPCs）接触共培养和非接触共培养；（四）胚胎中脑神经前体细胞（NPCs）单独培养做为对照组。共培养10天后，免疫荧光检测DA能神经元标记物TH的表达情况。　　 结果：第一组在接触共培养10天后偶见TH阳性细胞，但并无统计学意义；第二组正常星形胶质细胞与NPCs接触共培养和非接触共培养10天TH阳性细胞分别为24.89±6.32，16.57±4.03；表达DHH的星形胶质细胞与NPCs接触共培养和非接触共培养10天TH阳性细胞分别为25.39±6.01，14.72±2.90；第三组Sertoli细胞过表达DHH与NPCs接触共培养和非接触共培养10天TH阳性细胞分别为30.56±7.08，26.45±6.23；而加抗DHH抗体的Sertoli与NPCs接触共培养和非接触共培养10天TH阳性细胞分别为31.36±7.42，26.07±6.12。第四组NPCs单独培养10天TH阳性细胞为1.12±0.06。　　 结论：成功构建条件细胞COS7、NIH/3T3、9L、星形胶质细胞与NPCs的接触共培养和非接触共培养体系；成功从Sertoli细胞过表达DHH与阻断DHH发挥作用两方面建立诱导NPCs分化体系；DHH编码的蛋白不能或不能单独诱导与其共培养的NPCs定向分化为多巴胺能神经元。