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启动子是基因表达调控的重要顺式元件,也是基因工程表达载体的一个重要组成部分。启动子功能的强弱对于目的基因的表达至关重要。本课题以绿色荧光蛋白基因gfp为报告基因,在酿酒酵母和毕赤酵母中研究不同启动子对外源蛋白表达的影响。第一步,采用PCR扩增的方法克隆得到酿酒酵母甘油合成关键酶3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子pScgpd;第二步,借助于载体pYX212、pGAPZB和pPIC9K,构建pYX212-gfp和pYX-pScgpd-gf(ppYX-PG),pGAPZB-gfp和pGPDZB-gfp,pPIC9K-gfp和pPIC9K-PG;第三步,将重组载体分别转入S.cerevisiae W303-1A、P.pastoris X33和P.pastoris GS115中;最后在不同渗透压条件下培养重组菌,通过GFP的表达情况比较启动子pScgpd与磷酸丙糖异构酶启动子pTPI、3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子pGAP、甲醇氧化酶启动子pAOX1的功能。荧光显微镜观察结果显示,pScgpd表现为受高渗条件诱导,重组酿酒酵母S.cerevisiae W303-1A/pYX-PG、重组毕赤酵母P.pastoris X33/pGPDZB-gfp和P.pastoris GS115/pPIC9K-PG均能产生稳定的荧光,且在一定范围内随着葡萄糖或NaCl浓度的增加,GFP表达强度也有所增加;但与分别含有启动子pTPI、启动子pGAP和启动子pAOX1的S.cerevisiae W303-1A/pYX212-gfp、P.pastoris X33/pGAPZB-gfp、P.pastoris GS115/pPIC9K-gfp相比,表达水平仍较弱。在启动子功能比较的基础上,选定启动子pAOX1用于酿酒酵母几丁质酶基因Sccts的分泌表达。首先以S.cerevisiae W303-1A染色体为模板,克隆了1689bp的几丁质酶基因Sccts,与载体pPIC9K连接构建重组表达质粒pPIC9K-Sccts,电击转化得到重组P.pastoris GS115/pPIC9K-Sccts。通过G418筛选和摇瓶初筛复筛,得到高表达几丁质酶的重组毕赤酵母转化子。在摇瓶水平上,分别从底物浓度、接种量、甲醇浓度、诱导pH和诱导时间五个方面对几丁质酶的表达条件进行优化,得到的最适条件为:底物浓度5%、接种量3%、甲醇浓度2.5%、诱导pH6.4和诱导时间108h;最适条件下酶活最高为46.0U/mL。在5L发酵罐上对几丁质酶的罐上发酵条件进行初步研究,分别考察了初始搅拌转速、初始通气量、甲醇添加与溶氧耦联值和诱导温度对几丁质酶表达的影响,确定了初始搅拌转速为600r/min、初始通气量为3L/min、甲醇流加与溶氧耦联值为30%和诱导温度28℃时,几丁质酶的酶活最高,达到94.6U/mL。