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第一部分肾气丸对腺嘌呤致大鼠肾间质纤维化的作用及机制研究目的 观察肾气丸对腺嘌呤致大鼠肾间质纤维化的作用,探讨其延缓肾间质纤维化的作用机制,为更好地开展中药抗肾间质纤维化的研究提供新思路和新方法。方法 30只SD雄性大鼠随机分成正常对照组、腺嘌呤组、腺嘌呤+肾气丸组,每组10只,模型组给予150mg/kg腺嘌呤灌胃,连续35天;腺嘌呤+肾气丸组在造模第14天开始给予肾气丸(3g·kg-1)灌胃,连续21天;正常对照组每天灌服等量生理盐水。给药后第7、14、21天眼眶取血,分离血清检测BUN、Scr、TGF-β1含量,收集24h尿液检测UTP含量。末次给药后1h,麻醉大鼠,腹主动脉取血,分离制备血清;采用HE染色和PAS染色法观察肾脏组织病理学变化;Masson染色法观察大鼠肾间质纤维化程度;免疫组化法观察大鼠肾组织E-cadherin和Vimentin蛋白的分布;Western blot法检测大鼠肾组织E-cadherin和Vimentin蛋白表达变化;RT-PCR法检测大鼠肾组织TGF-β1 mRNA、Snail mRNA、Twist mRNA、LEF1 mRNA 和 Wnt4 mRNA 等基因表达变化。结果1.与正常组比较,腺嘌呤组大鼠血清BUN、Scr含量,尿液24hUTP含量显著升高(p<0.01),说明腺嘌呤造模对大鼠肾功能有一定损伤作用,且随着时间延长,肾功能损伤程度不断加重;与腺嘌呤组比较,肾气丸治疗7天后大鼠血清BUN和Scr显著降低,但尿液24h UTP无显著变化;治疗第14天和第21天,大鼠血清BUN、Scr和尿U-TP显著降低,差异有统计学意义(p<0.01)。2.腺嘌呤组肾小球大量坏死、崩解,间质纤维组织增生及炎性细胞浸润,肾小管上皮细胞脱落,肾小管阻塞,部分管腔出现蛋白渗出物,肾小动脉内膜增厚,管腔变窄,纤维化区域呈灶状分布,有显著的肾小管间质纤维化的特征,表明本实验造模成功。经肾气丸治疗后上述病理症状显著减轻。提示肾气丸具有减轻模型大鼠肾组织病理改变,保护肾脏功能的作用。3.与对照组比较,腺嘌呤组大鼠血清中TGF-β1含量随着时间的延长显著增加(p<0.01);与腺嘌呤组比较,肾气丸干预后大鼠血清中TGF-β1的分泌降低(p<0.01)。提示肾气丸可通过下调血清中TGF-β1的分泌,从而延缓肾小管间质纤维化的发生和发展。4.免疫组化结果显示:正常对照组大鼠在肾小管上皮细胞的细胞膜上E-cadherin蛋白呈强阳性表达,Vimentin表达少见;腺嘌呤组胞浆区可见Vimentin蛋白呈强阳性表达,E-cadherin蛋白的表达显著减少,与正常对照组比较均有显著性差异(p<0.01);与模型组比较,给予肾气丸治疗后,E-cadherin蛋白表达呈上升趋势,Vimentin蛋白表达呈下降趋势,差异有统计学意义(p<0.01)。提示肾气丸可显著抑制大鼠肾小管上皮细胞间充质转分化过程。5.Western blot结果显示:与正常对照组比较,腺嘌呤组大鼠肾组织E-cadherin蛋白表达下降,Vimentin蛋白表达增加,差异有统计学意义(p<0.01);与模型组比较,给予肾气丸治疗后,E-cadherin蛋白表达呈上升趋势,Vimentin蛋白表达呈下降趋势,差异有统计学意义(p<0.01)。6.RT-PCR结果显示,正常对照组比较,腺嘌呤组大鼠肾组织TGF-β1 mRNA、Snail mRNA、Twist mRNA、LEF1 mRNA 和 Wnt4 mRNA 基因水平显著增加,有显著性差异(p<0.01);给予肾气丸治疗后,TGF-β1 mRNA、Snail mRNA、Twist mRNA、LEF1 mRNA和Wnt4 mRNA基因水平呈下降趋势,差异有统计学意义(p<0.05)。结论 腺嘌呤致大鼠肾损伤模型存在明显的肾间质纤维化现象,而肾气丸可以显著改善模型组大鼠肾脏主要病理损害,提高E-cadherin蛋白表达,降低Vimentin 蛋白表达,同时降低 TGF-β1 mRNA、Snai1 mRNA、Twist mRNA、LEF1 mRNA和Wnt4 mRNA基因水平。提示肾气丸可能通过干预肾小管上皮细胞EMT信号通路中多个位点,从而延缓肾间质纤维化进程。第二部分 肾气丸对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞转分化的作用及机制研究目的 观察肾气丸对转化生长因子β1(Transforming growth factor beta 1,TGF-β1)诱导肾小管上皮细胞转分化的作用,探讨肾气丸抗肾间质纤维化的作用机制。方法 将体外正常培养的肾小管上皮细胞分为以下6组:无血清对照组、TGF-β1(10ng/ml)组、空白血清+TGF-β1(10ng/ml)组、肾气丸低剂量组(SQW-L,1.5g·kg-1)+TGF-β1(10ng/ml)、肾气丸中剂量组(SQW-M,3.0g·kg-1)+TGF-β1(10ng/ml)、肾气丸高剂量组(SQW-H,6.0g·kg-1)+TGF-β1(10ng/ml),在倒置显微镜下观察肾小管上皮细胞形态学的变化;免疫荧光法检测E-钙黏蛋白和波形蛋白表达变化:ELISA法检测细胞上清液中Col-I和FN含量的变化;Western blot 检测肾小管上皮细胞 E-cadherin、Vimentin、smad2/3、p-smad2/3、ILK、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin 等蛋白表达;RT-PCR 法检测细胞 E-cadherin mRNA、Vimentin mRNA、β-catenin mRNA、LEF1 mRNA、Wnt4mRNA 等基因表达。结果1.倒置显微镜下观察:1Ong/ml TGF-β1刺激72h后,NRK-52E和HK-2细胞形态发生显著改变,变成长梭形,类似于成纤维细胞,且细胞间隙变大;给予3.0g.kg-1与6.0g.kg-1肾气丸作用后,细胞的形态趋向于铺路石状,1.5g·kg-1肾气丸组无显著变化。2.免疫荧光结果显示:正常肾小管上皮细胞大量表达E-cadherin蛋白,表达少量Vimentin蛋白,E-cadherin主要分布与细胞膜,胞浆区少见;而10ng/ml TGF-β1刺激72h后,肾小管上皮细胞E-cadherin蛋白表达显著减少,而Vimentin蛋白表达显著增加,Vimentin主要分布于胞浆区;3.0g·kg-1与6.0g·kg-1肾气丸组能显著提高E-cadherin蛋白,降低Vimentin蛋白分布,1.5g·kg-1肾气丸组无显著变化。3.ELISA结果显示:与对照组比较,10ng/ml TGF-β1刺激72h后能促进肾小管上皮细胞分泌I型胶原Col-I和纤连蛋白FN(p<0.01);TGF-β1组与TGF-β1+空白血清组比较无统计学差异(p>0.05);与TGF-β1+空白血清组比较,3.0g·kg-1与6.0g·kg-1肾气丸与TGF-β1共同作用后,细胞上清Col-I和FN含量降低,肾气丸组变化显著(p<0.01),1.5g·kg-1肾气丸组无显著变化。4.Western blot结果显示:与对照组比较,1Ong/ml TGF-β1刺激72h后能显著提高肾小管上皮细胞Vimentin蛋白表达,降低E-cadherin蛋白表达,有显著性差异(p<0.01);TGF-β1组与TGF-β1+空白血清组比较无统计学差异(p>0.05);与TGF-β1+空白血清组比较,3.0g·kg-1与6.0g·kg-1肾气丸和TGF-β1共同作用后,细胞E-cadherin蛋白表达显著提高,Vimentin蛋白表达显著降低显著(p<0.05),1.5g.kg-1肾气丸组无显著变化。在肾小管上皮细胞中,1Ong/ml TGF-β1刺激15min即可激活p-Smad2/3,在30min时p-Smad2/3蛋白表达达到高峰,然后随着刺激时间的延长p-Smad2/3逐渐失活,Smad2/3蛋白表达无显著变化;TGF-β1刺激72h后,胞浆ILK、p-GSK-3β和核内β-catenin蛋白表达显著增加,总GSK-3β、β-catenin蛋白表达变化不显著。TGF-β1组与TGF-β1+空白血清组比较无统计学差异(p>0.05);与TGF-β1+空白血清组比较,3.0g.kg-1与6.0g.kg-1肾气丸组能显著抑制p-Smad2/3、ILK、p-GSK-3β、核β-catenin等蛋白的表达,1.5g·kg-1肾气丸组无显著变化。5.RT-PCR结果显示:与对照组比较,10ng/ml TGF-β1刺激72h后能显著提高肾小管上皮细胞 Vimentin mRNA、β-catenin mRNA、LEF1 mRNA 和 Wnt4 mRNA基因表达,降低E-cadherin mRNA基因表达,差异有统计学意义(p<0.01);TGF-β1组与TGF-β1+空白血清组比较无统计学差异(p>0.05);与TGF-β1+空白血清组比较,3.0g.kg-1与6.0g·kg-1肾气丸和TGF-β1共同作用后,细胞 E-cadherin mRNA 基因表达显著提高,Vimentin mRNA、β-catenin mRNA、LEF1 mRNA和Wnt4 mRNA基因表达显著降低(p<0.01),1.5g·kg-1肾气丸组无显著变化。结论 肾气丸能显著抑制肾小管上皮细胞转分化过程中Col-I和FN分泌,上调E-cadherin蛋白及E-cadherin mRNA基因表达,降低Vimentin蛋白及Vimentin mRNA 基因表达,抑制 p-Smad2/3、ILK、p-GSK-3β、nuclear-β-catenin等蛋白表达及抑制β-catenin mRNA、LEF1 mRNA和Wnt4 mRNA基因表达。提示肾气丸可能通过调控由TGF-β1介导的肾小管上皮细胞EMT信号通路中多个位点,抑制EMT过程,从而延缓肾间质纤维化进程。