目的:膀胱癌是最常见的泌尿系恶性肿瘤之一。由于对膀胱癌发生发展的分子机制缺乏准确的认知,目前膀胱癌的临床治疗手段仍十分有限。因此,深入研究膀胱癌发生及进展的分子机制有助于探索膀胱癌治疗的新靶标,实现膀胱癌的精准治疗。甲状腺激素受体互作蛋白13(thyroid hormone receptor interactor 13,TRIP13)在有丝分裂的纺锤体组装检查点和DNA双链断裂损伤修复中起到重要的作用。近年来,研究发现TRIP13在多种肿瘤中均异常表达且其表达水平与肿瘤的进展密切相关。然而,TRIP13与膀胱癌的关系目前尚未见详细报道。因此,本课题拟探讨TRIP13在膀胱癌及癌旁组织内的表达量差异,分析TRIP13表达量与膀胱癌患者临床病理参数及预后的相关性。研究敲减TRIP13表达对膀胱癌细胞增殖、细胞周期、凋亡及转移能力的影响。探究TRIP13在膀胱癌发生发展中的分子机制,为膀胱癌的分子机理和治疗策略提供理论依据。方法:1.对含有46例膀胱癌组织及配对癌旁组织的组织芯片进行免疫组化染色,分析TRIP13蛋白表达水平在癌组织内的改变。2.通过公共数据库Oncomine分析TRIP13在多种肿瘤内的表达情况。检索Oncomine和TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库内的膀胱癌相关数据进一步分析TRIP13在膀胱癌中的表达水平。3.对342例膀胱癌患者的肿瘤组织石蜡切片进行免疫组化染色并分析TRIP13表达量与临床病理指标的相关性。4.通过对公共数据库GEO(Gene Expression Omnibus)进行数据挖掘并选取GSE13507数据集来分析TRIP13表达量与膀胱癌患者预后的关系。5.在细胞水平:通过qRT-PCR检测6株膀胱癌细胞(T24、5637、HT-1197、TCCSUP、ScaBER及J82)内TRIP13的mRNA表达量。通过构建靶向TRIP13的干扰RNA慢病毒来敲减TRIP13在膀胱癌细胞T24和5637内的表达。以MTT实验、克隆形成实验、流式细胞术分析、划痕实验和transwell迁移实验分别检测TRIP13敲减对膀胱癌细胞T24及5637的增殖、克隆形成能力、细胞周期、凋亡和细胞迁移能力的影响。通过Western blot检测上皮间质转化相关蛋白来探索TRIP13是否参与膀胱癌的上皮间质转化。6.在动物水平:以靶向TRIP13的干扰RNA慢病毒实现对T24细胞中TRIP13的稳定敲减,并以该稳转株建立膀胱癌裸鼠皮下成瘤模型来探索TRIP13对膀胱癌细胞增殖能力的影响。7.TRIP13在膀胱癌中的作用机制分析:通过分析TRIP13敲减组与对照组T24细胞的全基因表达芯片数据并用IPA软件分析差异表达基因,研究TRIP13参与膀胱癌发生发展的分子机制。基于芯片的结果,选取若干与肿瘤形成密切相关的基因进行qRT-PCR及Western blot验证。在T24细胞中过表达Flag-TRIP13,通过免疫沉淀联合液相色谱-串联质谱技术鉴定TRIP13的互作蛋白。根据质谱鉴定结果,选取若干蛋白进行免疫共沉淀实验以验证TRIP13的互作蛋白,并在膀胱癌样本中验证临床相关性。结果:1.组织芯片的免疫组化结果显示TRIP13在膀胱癌组织中的表达量明显高于癌旁组织:我们在10例(21.7%)癌组织内检测到TRIP13的高表达而在正常的癌旁组织内仅有1例(2.2%)为TRIP13高表达。2.Onomine数据库分析结果显示TRIP13在20种肿瘤中均有异常高表达。在纳入的448例研究中,70例结果均显示TRIP13在癌组织内的表达高于癌旁正常组织(设定的倍数变化临界值为2)。通过对Oncomine和TCGA数据库内的膀胱癌数据进行分析,我们发现与癌旁正常组织相比,膀胱癌组织内的TRIP13表达量明显增高。3.342例膀胱癌患者肿瘤组织的免疫组化染色结果表明,TRIP13的表达量与年龄、性别、肿瘤大小无明显相关性,但与AJCC(American Joint Committee on Cancer)高分期,淋巴转移和远处转移显著相关。4.对GEO数据库内的数据集GSE13507进行Kaplan-Meier单因素生存分析,结果显示高表达TRIP13膀胱癌患者总生存时间(68.0月)明显低于TRIP13低表达患者(96月,P<0.01);高表达TRIP13膀胱癌患者疾病特异性生存时间(94.0月)明显低于TRIP13低表达患者(123.9月,P<0.001)。并且在非肌肉浸润性膀胱癌中,高表达TRIP13膀胱癌患者总生存时间(78.7月)明显低于TRIP13低表达患者(103.0月,P<0.05)。然而COX多因素生存分析显示,TRIP13并不能作为膀胱癌患者的一个独立预后因素。5.qRT-PCR结果显示TRIP13在膀胱癌细胞T24、5637、HT-1197、TCCSUP、ScaBER及J82中均有表达。靶向TRIP13的干扰RNA慢病毒转染膀胱癌细胞T24及5637后,TRIP13的表达量明显下降。MTT实验结果显示,与阴性对照组相比,TRIP13敲减组细胞增殖速度受到显著抑制。克隆形成实验中,TRIP13敲减组形成的克隆数目明显少于对照组,TRIP13敲减抑制了T24及5637细胞的克隆形成能力。流式细胞术检测结果显示,敲减TRIP13导致T24及5637的细胞周期阻滞于G2/M期并且诱导细胞凋亡。划痕实验及transwell迁移实验中,敲减TRIP13后,T24及5637细胞的迁移能力较对照组有显著下降。Western blot结果显示TRIP13敲减组上皮化指标E-caherin的表达明显升高,间质化指标fibronectin和vimentin的表达明显降低。6.裸鼠成瘤实验中,对照组10只小鼠均有肿瘤形成,而在TRIP13敲减组中仅有9只小鼠有可探及的肿瘤形成。TRIP13敲减组肿瘤体积的增长速度明显慢于对照组。小动物活体成像数据显示,对照组肿瘤的荧光信号强度明显强于TRIP13敲减组。在肿瘤净重上,TRIP13敲减组显著小于对照组。7.对比分析TRIP13敲减组与对照组T24细胞的全基因表达芯片结果,我们发现敲减TRIP13导致1175个基因的表达发生显著性变化,其中588个发生上调,587个发生下调。Gene Ontology分析结果显示,敲减TRIP13的表达后“间质化发展”这一生物学功能受到明显抑制,且差异表达基因的细胞定位集中于内质网膜,细胞核膜和胞质微管。为了进一步证实芯片的实验结果,我们以qRT-PCR和Western blot检测了TRIP13敲减后数个肿瘤形成相关基因的表达量变化。结果显示多个EGFR通路内的关键基因(ID1、Cox-2、Slug和EGFR)的mRNA和蛋白表达水平在TRIP13敲减后均有显著下降。此外,经典通路分析结果显示,差异基因富集度排名前15的通路中,有7条通路均与EGFR信号通路相关。液相色谱—串联质谱鉴定出共计2476种蛋白为TRIP13的潜在互作蛋白,其中包括多个EGFR通路内的关键蛋白,如EGFR、JAK2和AKT1。根据质谱鉴定结果,我们进行了免疫共沉淀实验来验证TRIP13能否与EGFR、JAK2或AKT1相互作用。结果显示,EGFR与TRIP13存在相互作用。对GSE13507的数据进行Pearson相关性分析,结果表明TRIP13与EGFR的表达量存在相关性(P<0.001)。Kaplan-Meier单因素生存分析结果显示TRIP13和EGFR均高表达膀胱癌患者的总生存时间(71.7月)明显低于二者均低表达的患者(100.3月,P=0.016);TRIP13和EGFR均高表达膀胱癌患者的疾病特异性生存时间(95.1月)明显低于二者均低表达的患者(125.4月,P=0.013)。结论:TRIP13在膀胱癌组织中的表达明显高于正常膀胱组织,且其表达水平与AJJCC高分期、淋巴转移及远处转移密切相关,TRIP13的高表达预示着膀胱癌患者不良的预后,提示TRIP13可以作为膀胱癌疾病进展及预后的一个生物标记物。TRIP13在膀胱癌发生发展中的作用及机制可能为通过与EGFR互作来调控EGFR信号通路及一系列下游信号通路,最终影响增殖、细胞周期、凋亡及迁移等生物学功能。