目的：　　了解近年来我院临床分离肺炎克雷伯菌分布特性和耐药状况，分析耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌在体外形成生物膜的能力和特点，并探讨其生物膜形成的相关机制，为有效防治耐药菌生物膜相关性感染提供理论依据。　　方法：　　1.回顾性调查2008年～2013年间温州医科大学附属第一医院临床分离的肺炎克雷伯菌的临床分布特征，并分析其对临床常见药物的耐药状况。　　2.耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的最低抑菌浓度(Mininal InhibotoryConcentrations，MICs)检测:采用琼脂稀释法检测37株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（指对碳青霉烯类药物亚胺培南、美罗培南、厄他培南中的至少一种药物表现出不同程度的敏感性下降或者耐药的菌株）对三种碳青霉烯类药物具体的MICs，结果根据2014年CLSI的标准判读。　　3.CRKP菌株生物膜测定:采用96孔板结晶紫染色法测定CRKP菌株体外生物膜形成能力。　　4.CRKP菌株生物膜形成相关表型和基因型检测:采用超粘表型试验和刚果红试验分析生物膜形成相关的细菌生长表型;采用PCR方法扩增CRKP菌株中的毒力基因，包括fimH、 mrkD、magA、rmpA、wzy-K2、wzx-K5、wzy-K20、wzx-K54、wzy-K57、wzy-K3;扩增并测序分析肺炎克雷伯菌的7个管家基因，比对数据库获得菌株具体的ST型别。分析生物膜形成能力与上述各种表型、基因、ST型别的相关性。　　5.测定多粘菌素B对CRKP菌株的MIC值和生物膜最低消除浓度(minimalbiofilm elimination concentrations，MEBC):采用琼脂稀释法检测多粘菌素对CRKP菌株的MIC值;96孔板培养生物膜，用不同浓度的多粘菌素处理预生成的生物膜，从而获得具体的MEBC。并比较二者的差异性。　　6.外排泵抑制剂CCCP对生物膜形成的影响及外排泵基因的检测:培养生物膜时在LB中加入不同浓度梯度的CCCP，分析外排泵抑制剂对生物膜形成是否有抑制或者诱导促进的作用;PCR的方法检测外排泵基因oqxA、oqxB的分布。　　7.细菌不同状态下外排泵基因表达量测定:采用实时荧光定量PCR的方法检测oqxB在细菌含/不含亚抑菌浓度CCCP的浮游状态下和生物膜状态下的表达差异情况。　　结果：　　1.917株肺炎克雷伯菌主要分离自痰液，分离率为50.8％(466/917)，其次为血液占16.1％(148/917)，尿液占14.4％(132/917)，创面占11.2％(103/917)，其他标本如脓液、引流液等共占7.4％(68/917);病区分布主要以ICU科室为主，占40.8％(374/917)，其次为神经外科和脑外科，共占17.8％(163/917);药物敏感性结果显示:我院肺炎克雷伯菌对氨苄西林的耐药率接近100％，对呋喃妥因的耐药率已高达74％，对包括头孢曲松、头孢他啶在内的三代头孢菌素类甚至是酶抑制剂复合药物氨苄西林/舒巴坦的耐药率也都在30％以上，仅对四代头孢菌素的头孢吡肟的敏感性较好;对喹诺酮类药物和氨基糖苷类药物的总体耐药水平较接近，处于20％～30％之间;仅对碳青霉烯类药物亚胺培南的敏感性最好，总体耐药率仅为4％，但CRKP的分离率在近几年中呈现明显的上升趋势。　　2.CRKP菌株生物膜形成能力高的菌株对碳青霉烯类药物的耐药性并不高于生物膜形成能力弱的菌株，甚至是生物膜形成能力较弱的菌株也能对碳青霉烯类药物表现出很高水平的耐药;具有超粘特性的菌株、产纤维素的菌株形成生物膜的能力并不比表型试验阴性的菌株强(P=0.582、P=0.865)，编码菌毛的毒力基因缺失的菌株形成生物膜的能力并没有降低(P=0.381)，ST11型别菌株生成生物膜的能力与其他型别相比无明显差异(P=0.726)。　　3.多粘菌素B对试验菌株的MIC值范围为0.25μg/ml～1μg/ml，都表现为敏感，而MBEC值的范围为3μg/ml～＞12μg/ml，都表现为耐药。但多粘菌素B对细菌的MEBC值的大小与细菌形成生物膜的能力(OD590)并没有相关性，即并不是生物膜的形成能力越强，MEBC就越高。　　4.含亚抑菌浓度CCCP的培养基下培养的生物膜的OD值比不含CCCP培养基培养的生物膜OD值都有不同幅度的提高，即亚抑菌浓度的CCCP对每株菌生物膜的形成能力都表现出不同程度的促进作用。另外，外排泵缺失的试验菌株比外排泵基因完整的试验菌株形成生物膜的OD值的水平低。　　5.细菌在生物膜状态、含CCCP浮游状态及含CCCP生物膜状态下外排泵基因oqxB的表达量均比其在不含CCCP的浮游状态下高。　　结论：　　1.本院临床分离的肺炎克雷伯菌标本来源主要为痰液，主要分离的科室是ICU，对多种药物耐药情况严重，仅对碳青霉烯类药物保持较好的敏感性，但CRKP菌株也表现出逐年增多的趋势。　　2.CRKP菌株形成生物膜的能力与碳青霉烯类耐药程度无相关性。　　3.本研究还证明生物膜形成能力与多种毒力因素的表型和基因型无关，且不具有特定的流行分布特点。　　4.多粘菌素B对试验菌株生物膜的MEBC值相较于对应菌株的MIC升高了3～48倍，在一定程度上解释了临床上发生的药物体外敏感而体内治疗无效的现象。　　5.多粘菌素B MBEC值的高低与细菌形成生物膜的OD值的高低之间没有相关性，提示生物膜细菌对抗菌药物的抵抗并不完全是通过生物膜的物理屏障作用阻止其渗透入细菌内部而产生的。　　6.亚抑菌浓度的外排泵抑制剂CCCP能促进CRKP菌株形成生物膜，提示外排泵能够影响CRKP菌株体外生物膜的形成。