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研究背景脂联素是脂肪细胞分泌的细胞因子,有调节糖脂代谢、改善胰岛素敏感性、抗动脉粥样硬化等作用。膳食脂肪酸是影响脂联素分泌的重要因素,油酸为单不饱和脂肪酸,在体内可调节血糖血脂、改善内皮功能、抗炎等。油酸调节脂联素的具体作用存在争议,且调节机制尚不明确,过氧化物酶体增殖物激活受体](PPARy)是核转录受体,其反应元件PPRE存在于脂联素基因启动子上,PPAR]激动剂可通过上调PPARγ促进脂联素表达。研究发现,高脂饮食诱导的肥胖小鼠体内CDK5被异常激活,可通过对PPARγ273位丝氨酸磷酸化下调脂联素的表达,故油酸对脂联素的调节作用是否同样通过PPARγ或者CDK5/PPARγ途径而实现,有待系统深入地研究。研究目的用不同浓度油酸作用于诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,观察油酸在不同浓度下对脂联素及PPARγ、CDK5等相关分子的作用,全面系统地探讨油酸对脂联素的调节作用;并选择可明显调节脂联素的油酸浓度,分别研究不同油酸调节脂联素的分子机制,为指导肥胖及代谢相关疾病的防治提供理论依据。研究方法1.体外培养并诱导分化成熟3T3-L1脂肪细胞,用不同浓度(25、50、100、200、400μmol/L)的油酸处理细胞24h,同时设立空白对照组及阳性对照组(单纯加入PPARγ激动剂Rosoglitazone,可促进脂联素表达),通过real-time PCR及Western-blot测定胞内脂联素、PPARγ、CDK5mRNA及蛋白表达。2.选择最能影响脂联素表达的油酸浓度处理细胞,通过real-time PCR及Western-blot测定脂联素、PPARγ、CDK5mRNA及蛋白表达,及PPARγser273磷酸化水平。3.在适宜浓度(10Oμmol/L)油酸中加入或不加入PPARy抑制剂GW9662处理细胞,同时设立空白对照组及抑制剂对照组(单纯加入GW9662),通过real-time PCR及Western-blot测定脂联素、PPARγ mRNA及蛋白表达,及PPARyser273磷酸化水平。4.在高浓度(400μmol/L)油酸中加入或不加入CDK5活性抑制剂Roscovitine处理细胞,同时设立空白对照组及抑制剂对照组(单纯加入Roscovitine),通过real-time PCR及Western-blot测定脂联素mRNA及蛋白表达,及PPARγser273磷酸化水平、p-CDK5(15Tyr)蛋白表达。研究结果1.不同浓度油酸对脂联素表达的调节作用不同,50、100μmol/L油酸可同时促进脂联素mRNA及蛋白表达(P<0.01;P<0.01),200μmol/L油酸可促进脂联素mRNA表达(P<0.05);在100μmol/L时促进作用最明显,随浓度升高油酸对脂联素的促进作用下降,在40μmol/L时抑制脂联素mRNA及蛋白的表达(P<0.01;P<0.05)。2.油酸在 50、100μmol/L 时可上调 PPA、Rγ mRNA(P<0.01;P<0.01)及蛋白表达(P<0.01;P<0.01),在100μmol/L时对PPARy表达的作用最明显,但不影响PPARyser273磷酸化水平(P>0.05);在4000μmol/L时PPARγ蛋白未发生改变(P>0.05),却可上调PPARγser273磷酸化水平(P<0.01)。不同浓度油酸对CDK5 mRNA及蛋白均无明显调节作用(P>0.05;P>0.05)。3.适宜浓度(100μmol/L)油酸在上调脂联素的同时上调PPARγ mRNA及蛋白表达(P<0.01;P<0.01),加入PPARγ抑制剂后,油酸对脂联素的上调作用受到抑制,脂联素mRNA及蛋白显著下降,甚至低于对照组(P<0.01;P<0.05)。4.高浓度(4000μmol/L)油酸在下调脂联素的同时上调PPARγser273磷酸化水平(P<0.01;P<0.01),并上调p-CDK5磷酸化水平(p<0.05),加入CDK5活性抑制剂后,p-CDK5磷酸化水平下降(P<0.05),PPARyser273磷酸化水平下降至对照组水平(p>0.05),同时脂联素mRNA及蛋白回升至对照组水平(P>0.05;P>0.05)。结论1.油酸对脂联素的调节作用随浓度而不同,在50、100、2000μmol/L时可上调脂联素mRNA表达,在50、100μmol/L使可上调脂联素蛋白表达,4000μmol/L时可抑制脂联素mRNA及蛋白表达。2.适宜浓度(10Oμmol/L)油酸可通过上调PPARγmRNA及蛋白促进脂联素的表达。3.高浓度(400μmol/L)油酸可能通过异常激活CDK5介导的PPARyser273磷酸化而抑制脂联素表达