研究背景有机体通过对基因特定及精细的时空表达调控来产生特定的细胞类型,这些调控发生在细胞生命活动的各个水平上。近来的研究业已阐明,除了转录水平的调控以外,转录后水平的调控对于基因的表达同样十分重要。microRNA(miRNAs)在这方面起着十分关键的作用。miRNAs是一种细胞内源性的,长度为19～21碱基对(bp)的小分子RNA,它们广泛的存在于包括植物,无脊椎动物和脊椎动物在内的各种生物体中。多方面的证据表明,miRNA不但在正常的细胞活动中发挥着关键的调节作用,而且在不同病理过程中也发挥着十分重要的作用。miRNA在生物机体内是呈组织特异性分布的,因此是转录后调控基因表达的一种精细的和有效的方式。miRNA另一个引人瞩目的特征是它们并不是起基因表达与否的开关作用,而是精细的调节基因的表达水平,这种情况下通常不发生mRNA的降解。与其它的组织和细胞一样,神经系统和神经细胞系也表达miRNA。其中的一此miRNA在神经系统表达丰富,并且有些miRNA仅表达于神经组织或神经细胞,例如miR-9, miR-124a, miR-125, miR-128以及miR-129。在神经系统表达的miRNA的种类比其它的器官表达的要多,这可能是由于神经系统存在多种类型及亚型细胞的缘故。为了理解miRNA表达的复杂性,进一步的研究揭示,在成年中枢神经系统不同的区域(如小脑,丘脑和海马)表达相似的miRNA,但是相应的miRNA表达水平在各个脑区有着显著的差异。对于miRNA在分化和发育过程中表达情况的研究同样取得了长足的进展。经过全反式视黄酸处理的畸胎瘤细胞将最终向神经样细胞的方向分化。伴随着细胞形态的变化,miRNAs(如miR-9 miR-124a及miR-125)的表达水平也随着时间的推移发生着显著的变化。这表明除了在成年神经系统中发挥作用以外,miRNA在神经系统的发育及神经细胞命运决定方面也起着十分重要的作用。miR-124a是在大脑中表达最丰富的miRNA,占全脑miRNA总量的25-48%,其核酸序列从线虫到人都十分保守。除此之外,人类的miR-124a-1基因座位于8号染色体短臂第二区第三条带,这一区域包括很多与神经精神疾病,如小头畸形,以及癫痫等疾病有关联的基因。在人宫颈癌细胞(HeLa cells)中过表达miR-124a会抑制大量非神经mRNA的表达。此外,神经发生抑制基因Ctdspl以及神经系统特异的差异剪切抑制基因Ptbp1已经在体外被证实为是miR-124a的靶基因,而且已经证实,在端脑敲除Dicer的小鼠中,Ptbp1的mRNA水平上升。通过在小鼠室管膜下区细胞中敲低miR-124a表达水平后,神经发生抑制基因sox9被鉴定为miR-124a的靶基因,这表明miR-124a通过抑制Sox9的翻译来调控神经发生。还有研究发现,niR-124a对鸡神经管发育过程中神经元的决定是必须的。相反,还有研究表明miR-124a并不参与鸡脊髓发育最初的神经发生过程。Dicer特异性敲除的小鼠在缺乏miRNAs的情况下最初的神经发生过程并没有受到影响。鉴于这些不一致的实验结果,miR-124a的靶基因及其在神经分化中的作用长期以来仍然不是很明了。对于miRNA在特定神经过程中功能作用的研究方兴未艾,而且miRNA的功能失调能够为我们理解神经退行性疾病的发生发展提供新的线索。由于miR-124a高表达于正在分化及已经分化的神经细胞中并且能作用于数以百计的mRNA,所以miR-124a可能会影响到如突起生长和突触形成等神经发育过程的诸多方面。最近的研究发现,miR-124a在神经发育过程中可能通过调节细胞骨架的活动从而影响神经突起的形成过程。但是]miR-124a实现这一功能的直接靶基因及其作用机制仍然鲜为人知。以往对miRNA作用靶点的寻找及研究多是在特定细胞系中通过过表达某种miRNA或者用miRNA抑制物降低所研究的miRNA的表达量之后,提取细胞的总RNA,然后利用RNA芯片技术测定所有基因mRNA的表达量,将结果与对照处理组相比较,之后对mRNA表达水平发生变化的基因作进一步的分析研究。这样做的优点很明显：能够一次性获得大量的信息,既有利于对发生变化的某些基因进行深入研究,也有利于利用生物信息学方法对miRNA的作用做整合分析。但是这样做同样存在很多不足之处。一方面,有机体内的生命活动表现为一个多层次立体的复杂网络结构,一个环节同其它的很多环节之间存在着相互影响,相互制约的关系,一个基因表达水平的变化会影响到许多其它基因的表达,因此,很难在基于基因芯片技术所得到的基因表达变化信息确定哪些是miRNA直接调控的靶标。另一方面,近些年的研究发现,miRNA对基因表达的调控主要包括两种机制：第一种是通过使mRNA降解来降低相应蛋白质的表达量,第二种则是通过抑制相应mRNA的翻译过程来实现对蛋白质表达量的控制。因此以往基于基因芯片的研究往往只能够对第一种情况下mRNA所调控的靶基因进行有效的研究,而往往遗漏了大量有miRNA通过翻译抑制途径对基因表达调控的信息。正是由于这些原因,所以我们利用网络生物信息学技术,通过候选基因的方法,结合相关文献信息,在预测出的miR-124a的靶基因中对与神经早期发育有关联特别是与神经突起生长有关的基因进行筛选,然后采用分子生物学的研究方法对预测的可能靶基因进行验证,最后在细胞水平上研究相关基因在神经细胞发育中的作用并对它们起作用的机制进行更加深入的研究。研究内容第一章miR-124a靶基因的预测及验证研究目的：利用网络生物信息学软件预测并挑选有可能在神经发育早期阶段起作用的miR-124a靶基因,然后构建带有预测靶基因3’非翻译区序列的报告基因载体,在人胚胎肾细胞(HEK293)细胞系中共转染报告基因和]miR-124a过表达质粒,验证miR-124a作用位点的有效性。研究方法：1.miR-124a靶基因的预测和选择利用著名的miRNA靶基因预测软件TargetScan,结合在文献上获得的相关基因功能的研究信息,对miR-124a的可能靶基因进行预测筛选。初步确定候选基因。2.构建筛选基因的验证检测质粒。首先根据预测的结果确定miR-124a在所预测基因mRNA的3’非翻译区的结合序列位置,然后根据每个基因在Genebank上的mRNA序列信息设计带有酶切位点的引物,引物扩增的序列应包含某个基因所有被预测出的miR-124a作用位点序列。将酶切后的DNA片段连接到也经过同样双酶切处理的pMIR-REPORT报告基因质粒或者pGL3-Control质粒上,构建报告基因质粒pGL3-Control-3’-ROCK1、 pGL3-Control-3’- STAT3、pGL3-Control-3’- GSK3β、pGL3-Control-3’-CBX2、 pMIR-3’-PPP1R13L、pMIR-3’-DNMT3b、pMIR-3’-CAPN6和pMIR-3’-GSK3β。然后将连接产物转化大肠杆菌,挑取克隆进行扩大培养后提取质粒,测序鉴定连入片段的序列的正确性。3.构建候选基因的miR-124a作用位点突变载体设计点突变引物,以候选基因ROCK1和CBX23’非翻译区序列的报告基因质粒pGL3-Control-3’-ROCK1和pGL3-Control-3’-CBX2为模板,用高保真DNA聚合酶KOD-Plus-Neo对报告基因进行突变反应PCR扩增,PCR产物经限制性内切酶Dpn1消化处理去除未突变的甲基化模板质粒后,将PCR产物经DNA纯化试剂盒纯化,转化大肠杆菌,挑取大肠杆菌克隆进行扩大培养并提取质粒。将质粒送往华大基因公司测序。4.荧光素酶报告基因实验转染前一天,将HEK293细胞种于48孔板中,每孔加入300微升无抗生素的培养基。将报告基因质粒,β-半乳糖苷酶表达质粒(pMIR-REPORT p-gal Control Plasmid)与在addgene购买的]miR-124a过表达质或miR-128对照质粒共转染HEK293细胞,24小时候用Promega公司的荧光素酶检测试剂(Bright-GloTM Luciferase Assay System)对荧光素酶的活性平进行检测,用Agilent公司的高敏感性β-半乳糖苷酶检测试剂盒(High Sensitivity β-Galactosidase Assay Kit)检测β-半乳糖苷酶的活性。以荧光素酶活性与β-半乳糖苷酶活性的比值作为荧光素酶的相对活性。5.免疫印迹实验用miR-124a过表达质粒或对照质粒转染人神经母细胞瘤,BE(2)-M17细胞,转染48小时后用细胞裂解液(RIPA Lysis Buffer)裂解细胞,测定浓度后进行SDS-PAGE凝胶电泳,观察候选基因ROCK1, CBX2和PPP1R13L的表达水平是否发生变化。6.统计学方法数据采用SPSS13.0统计学软件进行统计学处理。miR-124与对照miR-128对报告基因荧光素酶活的影响采用单样本的t检验,p<0.05为差异有统计学意义。结果1.经过生物信息学分析,查阅相关文献,初步确定DNMT3b、CAPN6、 HDAC4、PPP1R13L、STAT3、GSK3β、ROCK1和CBX2基因为候选基因。2.成功构建了所挑选的候选基因3’非翻译区序列报告基因载体3.获得ROCK1基因和CBX2基因的3’非翻译区序列点突变报告基因载体pGL3-Control-3’-mut-ROCK1, pGL3-Control-3’- mut-CBX2和pMIR-3’-mut-PPP1R13L。4.应用单样本t检验的统计学方法,荧光素酶报告基因转染实验显示与miR-128表达质粒相比,miR-124a表达质粒能够显著的降低报告基因质粒pGL3-Control-3’-ROCK1 (p=0.024), pGL3-Control-3’-CBX2 (t=2.887, p=0.046)和pMIR-3’-PPP1R13L (t=2.862, p=0.046)的荧光素酶的相对活性,结果有统计学意义。但是却不能够降低突变后的报告基因质粒pGL3-Control-3’-mut-ROCKl(t=0.573,p=0.597)和pGL3-Control-3’-mut-CBX2 (p=0.284, t=0.7914)的荧光素酶相对活性,结果没有统计学意义。miR-124a表达质粒也不能够降低DNMT3b (p=0.917)、CAPN6 (p=0.823)、HDAC4 (p=0.781)、STAT3 (p=0.819)和GSK3β(p=0.972)的3’UTR报告基因质粒的荧光素酶相对活性,结果没有统计学意义。5.免疫印迹结果显示,ROCK1基因,CBX2基因和PPP1R13L基因的表达水平在转染niR-124a过表达质粒hU6-hsa-miR-124a-CMV-GFP组均较对照质粒hU6-CMV-GFP组明显降低。结论初步确定ROCK1基因,CBX2基因和PPP1R13L基因为niR-124a的靶基因,并且niR-124a通过与三个基因的3’非翻译区相互作用来抑制这三个基因的表达。第二章ROCK1基因,CBX2基因和PPP1R13L基因对突起生长抑制作用的研究研究目的：利用视黄酸(RA)诱导及miR-124a过表达使人神经母细胞瘤BE(2)-M17细胞向神经样细胞分化为模型,探索ROCK1基因,CBX2基因和PPP1R13L基因在早期神经发育尤其是神经突起的生成和延伸过程中的作用。研究方法：1.质粒构建(1)相关基因过表达质粒的构建从人神经母细胞瘤BE(2)-M17细胞中提取总RNA,将总RNA反转录成cDNA。参考GenBank上ROCK1基因,CBX2基因和PPP1R13L基因的mRNA序列,设计带有酶切位点的引物扩增三个基因的编码区序列,然后经琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收目的片段,经双酶切后纯化,然后将回收的DNA片段连接入PmCherryN1红色荧光蛋白融合表达载体,构建成表达载体ROCK1-Cherry、 CBX2-Cherry和PPP1R13L-Cherry。(2)相关基因shRNA干扰质粒的构建参考文献上证明有效的RNA干扰序列,委托上海吉马公司构建ROCK1基因,CBX2基因和PPP1R13L基因的ShRNA过表达质粒pGPU6-shROCK1-CMV-GFP, pGPU6-shCBX2-CMV-GFP和pGPU6-shPPPlR13L-CMV-GFP2.细胞学实验(1) miR-124a过表达实验用脂质体转染试剂LipofectamineTM2000将miR-124a过表达质粒hU6-hsa-miR-124a-CMV-GFP或者对照质粒hU6-CMV-GFP转染入M17细胞,24小时后消化并收集细胞,将细胞再重新种于经多聚赖氨酸包被过的24孔细胞培养板中,等细胞贴壁后加入视黄酸(终浓度10uM)诱导分化。1天后用荧光显微镜观察细胞分化状况。(2)RNA干扰实验用脂质体转染试齐LipofectamineTM 2000将ROCK1基因,CBX2基因和PPP1R13L基因的ShRNA过表达质粒转染M17细胞,24小时后消化并收集细胞,将细胞再重新种于经多聚赖氨酸包被过的24孔细胞培养板中,等细胞贴壁后加入视黄酸(终浓度10uM)诱导分化。5天后用荧光显微镜观察细胞分化状况。(3)基因过表达实验用脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000将ROCK1基因,CBX2基因和PPP1R13L基因的过表达载体ROCK1-Cherry、CBX2-Cherry和PPP1R13L-Cherry分别和miR-124a过表达载体1iU6-hsa-miR-124a-CMV-GFP或者对照质粒hU6-CMV-GFP共转染M17细胞,24小时后消化并收集细胞,将细胞再重新种于经多聚赖氨酸包被过的24孔细胞培养板中,等细胞贴壁后加入视黄酸(终浓度10uM)诱导分化。24小时后用荧光显微镜观察细胞分化状态。3.Western blot实验先将P19细胞悬浮培养在培养细菌级别的培养皿中,培养基中加入终浓度1uM的视黄酸诱导4天,然后将细胞种于用多聚赖氨酸包被过的细胞培养板中,在细胞分化的不同时间点收集细胞,用免疫印迹Western Blot方法,检测P19细胞神经分化过程中相应候选基因ROCKl,CBX2和PPP1R13L在蛋白质水平的变化。4.统计学方法数据采用SPSS13.0统计学软件进行统计学处理。miR-124a促进突起生长实验突起长度niR-124a组与对照组采用两独立样本的t检验的方法。ShRNA干扰ROCK1、CBX2和PPP1R13L表达实验与ROCK1、CBX2和PPP1R13L过表达对突起生长影响的实验采用One-Way ANOVA统计学方法。P<0.05为差异有统计学意义。实验结果：1.ROCK1基因,CBX2基因和PPP1R13L基因的编码区序列成功连入PmCherryN1载体,过表达质粒ROCK1-Cherry、CBX2-Cherry和PPP1R13L-Cherry构建成功。2.MicroRNA过表达实验表明：当用视黄酸(终浓度10uM)诱导M17细胞分化后,转染niR-124a过表达质粒iU6-hsa-miR-124a-CMV-GFP的细胞在24小时内突起的长度与转染对照质粒hU6-CMV-GFP的M17细胞相比明显增长(t=6.054,p=0.026),差异有统计学意义。3.基因沉默实验表明,当用视黄酸(终浓度10uM)诱导M17细胞分化后5天,转染ROCK1基因,CBX2基因和PPP1R13L基因ShRNA表达质粒pGPU6-shROCK1-CMV-GFP, pGPU6-shCBX2-CMV-GFP和pGPU6-shPPP1R13L-CMV-GFP的M17细胞与转染对照质粒pGPU6-CMV-GFP的M17细胞相比,突起长度显著增加(F=,3.362,p=0.01,0.042,0.021),结果有统计学意义。4.共转染实验表明,当用视黄酸(终浓度10uM)诱导M17细胞分化后与空载体PmCherryN1相比,基因过表达质粒ROCKl-Cherry、CBX2-Cherry和PPP1R13L-Cherry均能够显著的抑制miR-124a过表达对M17细胞突起生长的促进作用(F=62.862, p=0.03; p=0.,001, P<0.001, P<0.001)差异有统计学意义。5.在P19细胞分化过程中,ROCK1基因,CBX2基因和PPP1R13L基因的蛋白表达水平均逐渐降低。结论：1,在视黄酸(终浓度10uM)诱导M17细胞分化过程中,miR-124a能够显著增强M17细胞神经突起的生长,差异有统计学意义。说明miR-124a具有促进神经早期发育的作用。2,分别降低ROCK1基因,CBX2基因和PPP1R13L基因的表达水平,均能够明显地促进M17细胞神经突起的生长。ROCK1基因,CBX2基因和PPP1R13L基因过表达均能够显著地阻碍miR-124a对分化M17细胞神经突起生长的促进作用。这些充分说明了miR-124a在神经发育早期阶段的重要作用,而且这一作用是通过抑制诸多对早期神经发育有抑制作用基因的表达来实现的。第三章miR-124a促进神经突起发育下游机制的研究研究目的：为了更深入研究miR-124a促进神经突起发育的下游机制,我们选取前面已经得到验证的miR-124a靶基因ROCK1为研究对象,参考相关文献,决定研究ROCK1与PI3K/AKT通路在神经发育过程中的可能的联系。研究方法：1.药物处理实验(1)在分化的M17细胞或P19细胞中加入ROCK1的抑制物Y-27632(10uM),在不同的时间点收集细胞,利用免疫印迹Western Blot技术检钡PI3K/AKT通路中AKT蛋白的磷酸化水平变化。(2)将ROCK1抑制剂Y-27632(10uM)单独加入或者与PI3K/AKT通路抑制剂LY294002(30uM)同时加入分化的M17细胞或者P19细胞,24小时后观察不同处理组神经突起生长的差异。(3)在用视黄酸(终浓度10uM)诱导转染有niR-124a过表达质粒hU6-hsa-miR-124a-CMV-GFP的M17细胞分化时,同时加入PI3K/AKT通路抑制剂LY294002(30uM)或DMSO,24小时后用荧光显微镜观察不同处理组神经突起生长的差异。2.Western blot实验(1)在P19细胞的分化过程中,在不同时间点收集细胞,利用免疫印迹Western Blot技术检钡PI3K/AKT通路中AKT蛋白的磷酸化水平变化。(2)在M17细胞中过表达miR-124a或者ROCK1的ShRNA质粒,48小时后收集细胞,利用免疫印迹western blot技术检钡PI3K/AKT通路中AKT蛋白的磷酸化水平变化。3.统计学方法数据采用SPSS13.0统计学软件进行统计学处理。抑制Akt活性阻碍ROCK抑制剂的促突起生长作用的实验数据采用One-Way ANOVA的统计学方法。抑制Akt活性阻碍niR-124:促突起生长作用的实验数据采用两独立样本的t检验方法。t<0.05为有差异有统计学意义。实验结果：1.在分化的M17细胞或P19细胞中加入ROCK1的抑制物Y-27632(10uM),能够显著增加AKT的磷酸化水平。2.在M17细胞中过表达miR-124a或者ROCK1的ShRNA质粒48小时后,AKT的磷酸化水平明显增加。3.ROCK1抑制剂Y-27632(10uM)能够显著的促进分化的M17细胞和P19细胞的突起生长(F=41.638, p=0.04; F=23.262, p=0.001)。而同时加入PI3K/AKT通路抑制剂LY294002(30uM)能够明显的抑制ROCK1抑制剂Y-27632对分化细胞突起生长的促进作用(F=41.638, p<0.001; F=23.262, p<0.001),结果有统计学意义。4.在用视黄酸(终浓度10uM)诱导转染了miR-124a过表达质粒hU6-hsa-miR-124a-CM V-GFP的M17细胞分化时,同时加入PI3K/AKT通路抑制剂LY294002(30uM)的处理组与加入DMSO的处理组相比较,LY294002处理对miR-124a促进突起生长的效应有明显的抑制作用(F=24.601,p<0.001),结果有统计学意义。5.在P19细胞分化过程中,伴随着ROCK1蛋白表达水平的逐渐降低,AKT的磷酸化水平逐渐升高。结论：miR-124a对于神经突起发育的促进作用部分是通过抑制ROCK1的表达,激活PI3K/AKT通路来实现的,鉴于PI3K/AKT通路在神经发育过程中的重要作用,这充分反映出：microRNA对基因转录后水平调节在神经发育过程中的重要作用。