研究背景及目的胃癌（Gastric Cancer,GC）是一个全球性的健康问题,全球每年新发病例超100万例。尽管过去5年全球发病率和死亡率有所下降,但胃癌仍然是癌症相关死亡的第四大原因。在新发的胃癌病例中,90%以上的病例都是腺癌,患者的5年平均生存率不到30%。导致这一现象的主要原因之一是诊断较晚,如果肿瘤在侵入胃肌层之前被检测并治疗,患者的5年生存率可达90%,但由于胃癌早期并无明显的特征性的临床症状,大多数患者在就诊时就已处于胃癌中晚期,治疗较困难且预后较差。目前,只有少数几个国家,例如日本,建立了胃癌普查计划,发病率和死亡率大幅下降。但在大多数国家和地区,目前仍没有相关的胃癌普查计划的建立,仍然面临着严峻的健康挑战。所以,对胃癌诊断及治疗的分子靶点的寻找及确定仍是癌症领域的研究热点。卵泡抑素样蛋白1（Follistatin-Like Protein 1,FSTL1）又称为卵泡抑素相关蛋白（Follistatin-Related Protein,FRP）,是FSTL家族中的一员,编码一种与卵泡抑素相似的蛋白,可以参与多种生理和病理过程,如胚胎形成、免疫调节、细胞增殖及细胞分化等。该蛋白还可以参与中枢神经系统、骨骼系统、肺和输尿管的发育及病理过程。最初,FSTL1被证明主要通过TGF-β/BMP信号通路来发挥作用,随着研究的逐步深入,FSTL1被发现还可以通过多种信号通路来参与不同的病理过程,例如通过TLR4/CD14途径参与炎症反应的发生;通过ERK1/2磷酸化途径参与心肌梗死的过程等。近年来,FSTL1在肿瘤中的作用也越来越被重视。目前,研究表明FSTL1在肺癌、结直肠癌、乳腺癌和卵巢癌等多种癌症中发挥着复杂的作用。例如,FSTL1可以通过调控Cx43来抑制肺癌细胞的迁移和侵袭;也有研究表明,FSTL1可以调控Bim磷酸化过程来抑制肺癌细胞的凋亡。在结直肠癌中,有研究发现FSTL1在结直肠癌组织中的蛋白表达水平显著低于对照组织;也有研究表明与配对的癌旁组织相比,结直肠癌组织中的FSTL1表达显著上调,且FSTL1高表达结直肠癌患者的预后较差。目前,关于FSTL1在肿瘤中的复杂作用仍没有十分明确,还需要进一步的研究,尤其是FSTL1在肿瘤中的具体调控机制。近年来,高通量测序及生信分析等技术被广泛应用于肿瘤的研究,对于寻找新的可用于肿瘤诊治的生物标志物及分子靶标提供了巨大的帮助。因此,在本研究中,我们首先通过对胃癌基因表达谱进行分析,并结合在线分析工具及相关软件的筛选,发现FSTL1可能参与胃癌的发生发展。通过组织学及细胞学实验,我们了解了FSTL1在胃癌组织及细胞中的表达情况,分析了FSTL1的表达水平对于胃癌患者预后的影响及其与胃癌病患临床病理参数之间的相关性。同时,为了深入了解FSTL1在胃癌发生发展中的作用,我们研究了FSTL1对于胃癌细胞生长增殖和迁移等生物学功能的影响。最后,通过筛选FSTL1的互作蛋白及分析FSTL1可能参与的信号通路,探讨FSTL1影响胃癌发生发展的作用机制。综上,通过这些研究,我们希望可以为阐明胃癌的发病机制提供理论依据,为胃癌的临床诊断及预后评估提供帮助。材料和方法1筛选胃癌相关的关键基因通过GEO2R在线工具分析GEO数据集中的差异表达基因;通过STRING数据库及Cytoscape软件筛选差异表达基因中的关键基因;通过DAVID、GEPIA、Oncomine、KM Plotter、Cbio Portal等在线数据库和软件对关键基因进行验证。2关键基因FSTL1的验证采用Western Blot实验检测AGS、MKN-28、SGC-7901、MGC-803、BGC-823、SNU-1和HGC-27等7种胃癌细胞及GES-1正常胃上皮细胞中FSTL1的蛋白表达水平;利用免疫组织化学染色法检测FSTL1在胃癌组织及癌旁组织中的蛋白表达水平。3 FSTL1对胃癌细胞生物学功能的影响包装慢病毒感染MGC-803和SNU-1细胞,构建FSTL1稳定敲低细胞模型,将细胞分为MGC-803-NC、MGC-803-KD、SNU-1-NC和SNU-1-KD四组;包装慢病毒感染AGS和MKN-28细胞,构建FSTL1稳定表达细胞模型,将细胞分为AGS-NC、AGS-OE、MKN-28-NC和MKN-28-OE四组。采用CCK-8实验、克隆形成实验检测FSTL1的敲低及过表达对于胃癌细胞增殖能力的影响;采用细胞划痕实验、Transwell实验检测FSTL1的敲低及过表达对于胃癌细胞迁移能力的影响。通过免疫组化对胃癌组织芯片进行染色;通过配对样本检验分析胃癌组织及配对癌旁组织中FSTL1的表达情况;采用Kaplan-Meier生存曲线分析FSTL1的表达对于胃癌患者总生存率的影响;通过卡方检验分析FSTL1的表达与胃癌临床病理参数之间的关系;通过单因素及多因素Cox回归比例风险模型分析各项病理参数及FSTL1的表达对胃癌患者预后的影响。根据胃癌病患的病理分级情况将胃癌组织芯片中的病例分为低病理分级组及高病理分级组,通过配对样本检验分析不同病理分级组中FSTL1的蛋白表达情况;采用Kaplan-Meier生存曲线分析不同病理分级组中FSTL1的表达对于胃癌患者总生存率的影响;通过单因素Cox回归比例风险模型分析不同病理分级组中各项病理参数及FSTL1的表达对胃癌患者预后的影响。4 FSTL1调控胃癌细胞增殖及迁移的可能机制通过STRING、Hit Predict、Int Act和Gene MANIA四个在线数据库筛选FSTL1互作蛋白;通过基因集富集分析筛选FSTL1可能参与的KEGG信号通路。研究结果1生信分析显示FSTL1在胃癌组织中的表达显著上调,且FSTL1的高表达与胃癌患者较差的总生存率及疾病无进展生存率显著相关。2 FSTL1在多种胃癌细胞中的表达上调,尤其是MGC-803和SNU-1细胞,并且敲低FSTL1显著抑制了MGC-803和SNU-1细胞的增殖和迁移;FSTL1在AGS和MKN-28细胞中的表达下调,且过表达FSTL1显著抑制了AGS和MKN-28细胞的增殖和迁移。3胃癌组织芯片总病例分析显示FSTL1在胃癌组织中的表达显著高于癌旁组织,其高表达与胃癌患者的不良预后相关;FSTL1的高表达与胃癌的较高的病理分级、较晚期的临床分期以及淋巴结转移显著相关;胃癌病患的肿瘤大小、病理分级、临床分期、淋巴结转移、FSTL1表达等因素可作为胃癌患者总生存率的独立预后因子。在病理分级较低的胃癌组织中,FSTL1的表达显著低于对照组织,FSTL1的低表达与胃癌患者的不良预后显著相关。在病理分级较高的胃癌组织中,FSTL1的表达显著高于对照组织,FSTL1的高表达与胃癌患者的不良预后显著相关,高病理分级组胃癌病患的肿瘤大小、淋巴结转移、FSTL1表达等因素可作为胃癌患者总生存率的独立预后因子。4 TGF-β1、BMP2、BMP4及FST可能是FSTL1的互作蛋白,TGF-β信号通路可能是FSTL1参与调控胃癌的通路之一。结论本课题研究表明,FSTL1在高分化胃癌细胞及病理分级较低的胃癌组织中的蛋白表达水平较低,明显抑制了AGS和MKN-28细胞的增殖和迁移,可能在胃癌发生的早期抑制了肿瘤生长;FSTL1在低分化胃癌细胞及病理分级较高的胃癌组织中的蛋白表达水平较高,显著促进了SNU-1和MGC-803细胞的增殖和迁移,可能在胃癌的晚期促进了其发展。