论文部分内容阅读
南极是人类共有的资源宝库,含有多种矿物质资源的同时也蕴含着丰富的生物资源。南极地区生存环境恶劣,低温、酷寒、高盐、昼夜温差大、紫外辐射强等因素使得该地区大型生物种类单一,但微生物独特的生理特性及代谢机制使得其能够在南极地区大量生存、繁衍,对该地区微生物进行研究,不但可以发掘许多未知的微生物种群,丰富微生物基因库,还可以获得多种功能独特的生物活性物质。本文以产褐藻胶裂解酶的南极真菌Aspergillus sp.22-5为研究对象,采用基因工程技术克隆获得褐藻胶裂解酶基因(Aly-i7)并进行异源表达,纯化并研究了重组褐藻胶裂解酶(Aly-i7)的酶学性质,同时对其降解产物在农业领域的应用潜力进行了初步探索,为酶法降解褐藻胶以及褐藻寡糖在农业上的应用提供了科学依据。本文利用褐藻酸钠为唯一碳源培养基,对南大洋沉积物样品中的菌落进行了选择性培养和筛选,共分离获得10株具有褐藻胶降解能力的真菌,种属鉴定表明,其中有红酵母属(Rhodotorula sp.)4株,青霉菌属(Penicillium sp.)3株,曲霉属(Aspergillus sp.)3株。本文以酶活力最高的曲霉菌Aspergillus sp.22-5为出发菌株,通过转录组分析注释获得疑似褐藻胶裂解酶基因(Aly-i7),采用基因工程手段将Aly-i7连接到表达载体pET30(a+)中,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),实现了Aly-i7的异源表达。诱导结果表明,0.8mmol/L IPTG在16℃条件下诱导16h能够显著提高重组酶Aly-i7的表达量。经镍柱纯化可得到单一条带的重组酶Aly-i7,SDS-PAGE凝胶电泳实验结果表明重组褐藻胶裂解酶Aly-i7的分子量约为40kDa,纯化倍数为49.34,回收率为25%,酶活力达17.46U/mL,比酶活力达14.31U/mg。本文以重组酶Aly-i7为研究对象,对其底物特异性、最佳反应温度及稳定性、最适pH及稳定性、不同金属离子的影响、降解产物等方面的酶学特性进行了研究。结果表明,Aly-i7是一种偏好poly G底物的双功能裂解酶,对卡拉胶、琼胶、可溶性淀粉及纤维素均没有降解能力。Aly-i7最适反应温度为50℃,最适pH为7.0,在50℃、pH7.0条件下的半衰期约为230min;金属离子Na+、K+及Ca2+对Aly-i7的酶活具有一定的促进作用,而Zn2+、Fe3+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、EDTA则对Aly-i7的酶活产生明显的抑制作用,其中以Cu2+的抑制作用最强,5mmol/L可使Aly-i7接近失活。薄层层析(TLC)实验表明,Aly-i7与褐藻酸钠反应酶解终产物主要为二糖,十分有利于产物的纯化。本文通过将不同浓度的酶解寡糖喷施于感染白粉病的黄瓜来检测其防治效果,并进行盆栽实验观察,结果表明,5%酶解寡糖处理组的防治效果达86.05%,其防治效果高于1%武夷菌素的阳性对照组(63.71%),喷施酶解寡糖的处理组在黄瓜感染白粉病时,黄瓜叶上的斑点小、少且菌层薄,死苗率低,这表明由Aly-i7制备的褐藻寡糖在植物疾病防治领域具有潜在的应用价值。