论文部分内容阅读
大岩桐（Sinningia speciosa）原产巴西，是苦苣苔科岩桐属多年生球根草本花卉，是一种春夏季节室内盆花，世界各地广泛栽培。大岩桐喜温暖，不耐低温，5C以下难以越冬，培育抗寒品种有望实现非温室越冬，扩大种植面积，降低生产成本。大岩桐播种后160-210d开花，营养生长期较长，培育早花品种，可提早上市，提高商业价值。本课题将AtCBF1抗寒调控基因和AtLEAFY早花基因通过根癌农杆菌LBA4404介导分别转化大岩桐，主要结果如下：（1）建立了大岩桐的再生体系。先将盆栽的生长旺盛的大岩桐幼嫩叶片用酒精、升汞消毒，放入芽诱导培养基中进行培养，诱导产生不定芽。然后，用切掉茎尖的不定芽进行继代增殖。最后，切下小芽进行生根，形成再生植株并移栽成活。获得各培养阶段适宜的培养基配方：芽诱导和继代增殖培养基，MS+0.5mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA；生根培养基，1/2MS+0.2mg·L-1NAA。（2）构建拟南芥中抗寒基因AtCBF1和早花基因AtLEAFY的植物表达载体。以拟南芥叶片cDNA为模板，扩增得到CBF1基因，利用BamH I和Sac I酶切位点，将AtCBF1与质粒pBI121连接，构建植物表达载体pBI121-AtCBF1；以拟南芥花蕾cDNA为模板，扩增得到LEAFY基因，利用Xma I和Sac I酶切位点，将AtLEAFY与质粒pBI121连接，构建植物表达载体pBI121-AtLEAFY，将构建好的表达载体转化根癌农杆菌LBA4404。（3）以红、紫色花重瓣大岩桐叶片、叶柄为材料，进行愈伤组织及不定芽的诱导。诱导培养基MS+1.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA和MS+2.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA均能诱导产生愈伤组织和不定芽，但是芽的分化前者比后者要快。以大岩桐无菌苗叶片为材料，进行再生芽的卡那霉素（Kan）浓度梯度实验，确定了20mg·L-1Kan为叶片诱导出芽筛选压。以大岩桐无菌苗不定芽为材料，进行再生根的卡那霉素（Kan）浓度梯度实验，确定了10mg·L-1Kan为生根筛选压。（4）用含有CBF1/LEAFY基因的农杆菌LBA4404侵染叶片、叶柄外植体后，先诱导出芽，再诱导生根，最终得到候选转基因植株。CTAB法提取候选转基因植株的DNA，经PCR鉴定，已获得大岩桐CBF1转基因植株，并对大岩桐CBF1转基因植株的抗寒性进行了初步鉴定。目前，LEAFY转化植株的鉴定工作正在进行中。