食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,全世界每年约有30万人死于食管癌,严重危害人类的生命和健康。我国是世界上食管癌高发区之一,河南省林州市食管癌的发病率和死亡率又居全国之首,因此,探讨食管癌的发生机制、早期诊断及靶向治疗已成为国内外研究的热点。线粒体是真核细胞的重要细胞器,生物氧化和能量转换等功能主要是在线粒体内进行。线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)存在于线粒体内膜上,是一种特殊类型的DNA,它是唯一存在于核外的遗传物质,分为非编码区(D-Loop区)和编码区。mtDNA的结构特点与核DNA(nuclear DNA,nDNA)相比,其分子量相对较小,缺乏组蛋白保护和必要的损伤修复系统,又直接暴露于线粒体高反应氧中,且具有母系遗传的特点。因此mtDNA比nDNA更易受氧化性损伤和致癌物的攻击,进而引起突变和拷贝数的改变。研究认为,肿瘤的发生发展是一个多因素、多阶段和多基因突变的复杂演进过程,目前的研究多集中在细胞核基因组中癌基因和抑癌基因的变化,但仍有很多问题不能仅用核基因的变化来解释。近年来,随着对线粒体研究的深入,发现了存在于线粒体内膜上的mtDNA,认为肿瘤的生物学特征不仅取决于核内遗传物质,而且与核外的mtDNA关系密切。以往的研究表明,mtDNA拷贝数的改变与白血病、神经胶质瘤细胞、肝癌、胃癌等肿瘤关系密切。同时有学者认为mtDNA的突变可能参与了细胞的恶变,并在头颈部肿瘤、甲状腺肿瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、肝细胞癌、结肠癌、膀胱癌等多种肿瘤中证实了这一观点。有关mtDNA与肿瘤关系的研究虽有一些报道,但mtDNA与食管癌发生、发展关系的系列性研究,特别是mtDNA与食管鳞癌发生、发展及细胞凋亡的关系,迄今国内外未见报道。为进一步阐明mtDNA与食管鳞癌发生、发展的关系,探讨抑制食管鳞癌发生、发展的有效方法并为食管癌的线粒体靶向治疗提供理论依据,本研究在同一样品中同时提取mtDNA和nDNA后,采用半定量PCR及实时荧光定量PCR等技术,系统地检测了62例高发区食管鳞癌组织、31例癌旁不典型增生组织及62例正常食管黏膜中mtDNA数量的变化;采用纯化的PCR产物测序方法,对31例食管鳞癌、31例癌旁不典型增生组织及31例正常食管黏膜的mtDNA的ND1基因全部测序,以期了解mtDNA的ND1基因突变与食管鳞癌发生、发展的关系;通过建立食管鳞癌细胞EC9706和TE－13无mtDNA的p°细胞,采用半定量PCR、实时荧光定量PCR、TUNEL染色和流式细胞技术,观察mtDNA拷贝数与细胞凋亡的关系,以期为食管癌的线粒体靶向治疗提供理论依据。本实验分为以下三部分:第一部分线粒体DNA数量变化与食管鳞癌发生、发展的关系方法1.分别扩增62例食管鳞癌组织、31例癌旁不典型增生组织和62例正常食管黏膜中的mtDNA编码区(3490bp-3892bp,共403bp),并以β-actin作为定量标准物,琼脂糖凝胶电泳比较mtDNA在食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织和正常食管黏膜间的差异。2.采用实时荧光定量PCR技术定量检测62例食管鳞癌组织、31例癌旁不典型增生组织和62例正常食管黏膜中的mtDNA拷贝数;并采用凝胶电泳对mtDNA进行定性检测。3.统计学处理:应用SPSS13.0软件处理,资料以均数±标准差((?)±s)表示,均数的比较采用t检验及方差分析,检验水准α=0.05。结果1.62例食管鳞癌组织、31例癌旁不典型增生组织和62例正常食管黏膜中mtDNA的相对含量分别为1.604±0.195、1.533±0.147、1.401±0.185。食管鳞癌组织中mtDNA相对含量高于癌旁不典型增生组织及正常食管黏膜,组间比较差异有统计学意义(F=19.536,P<0.05)。2.在62例食管鳞癌组织、31例癌旁不典型增生组织及62例正常食管黏膜中的mtDNA的检出率均为100%(62/62,31/31,62/62),而mtDNA的平均拷贝数的Ct值分别为25.394±1.380,26.068±1.792,26.835±1.949,组间比较差异有统计学意义(F=11.020,P<0.05)。第二部分食管鳞癌组织中线粒体DNA编码区ND1基因突变及其与拷贝数量关系的研究方法1.利用PCR技术扩增31例食管鳞癌组织、31例癌旁不典型增生组织和31例正常食管黏膜中mtDNA的编码区ND1基因。2.回收、纯化mtDNA编码区ND1基因的PCR产物并进行测序。3.统计学处理:应用SPSS13.0软件处理,资料以均数士标准差((?)±s)表示,均数的比较采用t检验及方差分析,检验水准α=0.05。结果1.在31例食管鳞癌和癌旁不典型增生组织中,其mtDNAND1基因均有9例发生突变,突变率为29.03%,且突变均为同一位点突变(C3971T,T3553A),未发现其它类型的突变。而在31例正常食管黏膜中,mtDNA ND1基因均未发现突变。2.食管鳞癌组织中,ND1基因突变区的mtDNA拷贝数与非突变区的mtDNA拷贝数相比,差异显著(P<0.05)。在食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织和正常食管黏膜中,mtDNA的平均拷贝数的Ct值分别为25.558±1.0789、26.324±1.897、26.932±0.530;癌旁不典型增生组织及食管鳞癌组织均有9例发生突变,其突变Ct值分别为24.774±1.129、23.921±1.0574,组间比较差异有统计学意义(F=5.184、14.861;P均<0.05)。第三部分人食管鳞癌EC9706和TE-13细胞中线粒体DNA与细胞凋亡的相关性研究方法1.培养人食管鳞癌细胞EC9706和TE-13,用溴乙啶(EB)处理获得完全缺失mtDNA的细胞(p°细胞)。2.利用实时荧光定量PCR技术,检测EB处理后不同时间的人食管鳞癌细胞EC9706和TE-13 mtDNA的拷贝数;并采用琼脂糖凝胶电泳对mtDNA进行定性检测。3.利用PCR技术,扩增人食管鳞癌细胞EC9706和TE-13 mtDNA编码区ND1基因,并将PCR产物回收、纯化后进行测序。4.采用TUNEL染色和流式细胞技术,检测EB处理后不同时间人食管鳞癌细胞EC9706和TE-13的凋亡情况。5.统计学处理:应用SPSS13.0软件处理,资料以均数±标准差((?)±s)表示,均数的比较采用t检验及方差分析,检验水准α=0.05。结果1.成功建立了人食管鳞癌细胞EC9706和TE-13的p°细胞,经实时荧光定量PCR鉴定,发现在EB的存在下,随着细胞分裂,mtDNA拷贝数进行性减少,直到12d,mtDNA完全丢失。2.检测人食管鳞癌EC9706和TE-13细胞mtDNA的ND1基因序列,发现均存在C3971T突变。3.检测了人食管鳞癌细胞EC9706和TE-13的p°细胞系培养过程中对照组和EB处理后第4、8、12d的mtDNA拷贝数量,发现:从第4d到第12d其拷贝数量逐渐递减,第12d为零,无mtDNA。4.本实验率先检测了人食管鳞癌细胞EC9706和TE-13的p°细胞培养过程中对照组和EB处理后第4、8、12d的细胞凋亡的情况。经流式细胞术检测发现,从第4d到第12d其凋亡率逐渐增加;TE-13的凋亡率(%)分别为16.42±0.70、59.80±0.49、68.80±0.21;EC9706的凋亡率(%)分别为2.784±1.04、11.68±1.85、26.62±1.06。TUNEL检测结果与上述一致,从第4d到第12d凋亡率亦逐渐增加。结论1.在同一组织中同时提取mtDNA和nDNA,节省组织,缩短时间,减少费用,操作简单,并且对疾病的研究,两者更具可比性及相关性更有说服力。2.运用半定量PCR技术,检测食管鳞癌发生、发展不同阶段组织中mtDNA,发现由正常食管黏膜、癌旁不典型增生及食管鳞癌组织,其mtDNA的数量依次增加,提示mtDNA数量的增加与食管鳞癌的发生、发展密切相关。3.采用实时荧光定量PCR检测mtDNA,发现正常食管黏膜、癌旁不典型增生及食管癌组织中mtDNA的拷贝数呈逐渐递增的趋势,提示mtDNA拷贝数量的增加与食管鳞癌的发生、发展密切相关。4.对不同食管病变组织中mtDNA的ND1基因测序发现,29.03%的癌旁不典型增生及食管鳞癌组织发生ND1基因(C3971T,T3553A)突变,而正常组织中均未发现该基因突变,提示mtDNA突变可能在食管癌的发生和发展中起一定的作用。对人食管癌细胞EC9706和TE-13mtDNA的ND1基因测序,仅发现C3971T突变,进一步证实了mtDNA的ND1基因突变与人食管癌关系密切。5.突变组mtDNA拷贝数量明显高于未突变组mtDNA拷贝数量,两者相比有显著差异,提示mtDNA突变与mtDNA拷贝数量密切相关。6.成功建立了EC9706和TE-13的P°细胞,为进一步研究mtDNA与食管癌的关系提供了新的技术手段。7.随着EC9706和TE-13两细胞株mtDNA拷贝数量的逐渐减少,两细胞株中的凋亡率均逐渐增加,表明mtDNA在诱导细胞凋亡中起着一定调控作用。提示选择性地诱导食管癌细胞mtDNA损伤,致使食管癌细胞mtDNA拷贝数量明显减少,进而诱导细胞凋亡增加,可望成为食管癌生物治疗的一个新靶点。本研究创新点:1.首次运用同一组织同时提取mtDNA和nDNA,节省组织,缩短时问,减少费用,操作简单,对研究肿瘤及其它相关疾病更有说服力。2.率先运用半定量PCR、荧光定量PCR方法检测食管鳞癌组织发生不同阶段组织中mtDNA的数量及mtDNA的拷贝数。3.首次对正常食管黏膜、癌旁不典型增生组织和食管鳞癌组织的mtDNA的ND1基基因纯化并全部测序,发现在癌旁不典型增生和食管鳞癌组织中ND1基因点突变位点为C3971T,T3553A。4.首次建立了人食管鳞癌EC9706和TE-13的p°细胞系,为进一步研究mtDNA与食管癌的关系提供了新的技术手段。5.首次检测了人食管鳞癌细胞EC9706和TE-13mtDNA拷贝数的改变与凋亡的关系,并对二细胞系中mtDNA的ND1基因测序,发现ND1基因点突变位点为C3971T。6.首次发现经EB处理后的两种细胞mtDNA的拷贝数逐渐减少,到第12dmtDNA的拷贝数为零,而两种细胞数的凋亡率逐渐增加。