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神经可塑性(Neuroplasticity)涉及到了神经元结构与功能的一系列变化。因此,多种神经、精神类疾病的发生与发展都与神经可塑性的破坏有密切的关系。海马与学习、情感、记忆及神经结构的可塑性等高级认知功能有密切的关系。神经可塑性的调节与平衡涉及了神经细胞的多种信号通路,如G蛋白偶联受体(GPCR)系统、Wnt信号通路、Hippo信号通路、RhoA/ROCK信号通路等。CCDC152(Coiled-coil Domain Containing Protein 152)是一个功能未知的蛋白,属于CCDC家族的一个成员,共含有254个氨基酸,其结构元件是卷曲螺旋。转录组测序检测发现,CCCDC152的功能和上述多种信号通路的调节有关。本研究从CCDC152的蛋白结构预测出发,结合其影响的与神经细胞可塑性及各信号通路相关分子,通过多种实验方法探究了 CCDC152在神经细胞可塑性及各信号通路中的作用。主要研究方法和结论如下:研究方法:1.转染pGL2-CCDC152荧光素酶报告基因表达载体,通过荧光素酶报告基因的表达检测影响CCDC152启动子活性的因子。2.WesternBlot检测CCDC152在2,5-二甲氧基-4-碘安非他明(DOI)、溶血磷脂酸(LPA)等GPCR受体激动剂诱导下的表达及神经可塑性相关信号系统的影响。3.过表达或干涉CCDC152,用cAMP-ELISA检测试剂盒检测cAMP含量。4.过表达或干涉CCDC152,用流式细胞仪检测钙离子含量。5.过表达CCDC152,Western Blot检测神经可塑性相关蛋白Egr-1、SYP、Neurabin-Ⅱ、HSP70、HSPA6、Calpain1等的表达情况。6.Western Blot检测在DOI诱导下,CCDC152及GPCR、Wnt、Hippo以及Integrin等下游信号系统相关蛋白Egr-1、Calpain1、TEF-1、Vinclin等的表达情况。7.LPA及ROCK抑制剂Y-27632处理HT22细胞及HT22-CCDC152敲除细胞,Western Blot检测RhoA/ROCK系统关键靶蛋白如p-Cofilin、p-LIMK等的表达情况,研究CCDC152对RhoA/ROCK信号转导的调节作用。8.LPA及ROCK抑制剂Y-27632处理HT22细胞及HT22-CCDC152敲除细胞,鬼笔环肽染色法研究细胞骨架F-actin的变化情况,研究CCDC152表达对细胞骨架的影响。实验结果:1.CCDC152启动子活性受五羟色胺受体激动剂DOI的调节,并呈现出低浓度的激活作用和高浓度的抑制作用。不同浓度DOI处理对HT22细胞CCDC152表达有影响,且10uM时作用最为明显,故结合细胞生理条件,选择10uM作为实验的处理浓度。以不同时间点处理细胞,发现lh以内处理的细胞中5-30min有促进作用,2-48h处理则不同程度抑制表达,这与五羟色胺受体的钝化作用有关。2.Gαi的抑制剂PTX对DOI调节的CCDC152的表达有影响。使用多种GPCR信号通路的相关试剂剂KCl、PMA、CTX、PTX,均会影响DOI对CCDC152表达的调节作用。反过来,过表达或干涉CCDC152,对DOI引起的cAMP、Ca2+浓度的变化有调节作用。3.CCDC152与神经细胞凋亡相关因子Calpain 1、Cas 9,神经细胞保护因子HSPA6、HSP70,神经细胞可塑性和记忆调节因子SYP、Egr-1、EGR3、Neurabin-Ⅱ等蛋白之间都有相互影响和调节,当CCDC152过表达时,Calpain 1、Cas 9、HSPA6、HSP70、SYP、Egr-1、EGR3的表达均减少,而Neurabin-Ⅱ的表达增多。4.CCDC152的表达在HT22细胞的LPA处理中,0-1h时,CCDC152的表达有一个起伏波动,这种作用方式与激素的脉冲式的作用方式类似。在0-48h处理中,后期CCDC152表达有明显下降,这种作用方式与受体的钝化作用有关。5.CCDC 152的表达在HT22细胞中LPA诱导下对RhoA/ROCK系统相关蛋白表达的影响:CCDC152通过调节Cofilin的磷酸化进而影响细胞内应激纤维的形成。在HT22细胞和HT22-CCDC152敲除细胞中,LPA都能够激活ERK1/2的磷酸化,ROCK抑制剂Y-27632并不能抑制ERK1/2的磷酸化。6.CCDC152在LPA诱导下对细胞骨架F-actin结构的影响:正常HT22细胞在LPA作用下,Rho/ROCK激活增强了Cofilin和MLC2的磷酸化,导致细胞内应激纤维的形成即微丝的稳定性,表现为神经细胞树突的伸长(Neuriteoutgrowth)的抑制;HT22-CCDC152敲除细胞在加入LPA的作用下,树突生长显著增长,但是细胞皱缩明显,说明CCDC152主要通过抑制Rho/ROCK1-p-MLC2调节细胞内应激纤维的形成。实验结论:1.CCDC152的表达与Gαq的激活及其他信号通路的相互作用有关。2.CCDC152在神经可塑性方面以及记忆和神经系统保护等方面发挥着重要的调节作用,并与Wnt系统、Hippo系统、RhoA/ROCK系统等密切相关。3.CCDC152对ERK1/2的磷酸化没有影响。4.CCDC152在神经细胞中通过调节Rho/ROCK 1和MLC2的磷酸化影响了神经细胞的可塑性调节。