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研究背景糖尿病肾病（Diabetes Nephropathy,DN）是糖尿病最常见的微血管并发症,见于30%-40%的糖尿病患者,是导致终末期肾病（End stage renal disease,ESRD）的重要病因,也是预测慢性肾脏病（Chronic Kidney Disease,CKD）患者死亡的独立危险因素。控制血糖、血压及抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统（Renin-Angiotensin System,RAS）虽然有助于降低DN发病并延缓其进展,但并未改善DN的诊疗现状,迫切需要加强机制研究,寻找新的防治策略。近期研究发现,固有免疫识别内源性损伤信号和外源性抗原分子相关的慢性炎症在DN中发挥重要作用。动物实验中肠道异常增殖的致病微生物,可直接被肠固有免疫细胞识别,并可通过白介素22（Interleukin 22,IL22）减轻肺的炎症反应;而IL22减轻DN肾小管间质损伤在动物实验中已得到证实,那么肠道菌群变化是否可能也通过IL22参与DN的发生发展?肠道菌群与药物之间的相互作用备受关注,药物可能导致肠道菌群失调,而肠道菌群失调又反过来影响降糖药物的疗效和副作用。肉桂醛（Cinnamaldehyde,CIN）是新型天然降糖药物,已有报道可减轻DN蛋白尿;同时具有抗菌作用,那么其对DN的保护作用,是否是通过调节肠道菌群,进而影响肾脏固有免疫及IL22相关炎症反应而实现?因此本研究将基于DN大鼠模型,探索DN进展过程中的肠道菌群结构与功能改变,寻找可能的关键微生物。并观察肉桂醛干预对DN大鼠肠道菌群的影响,初步探究其可能的机制。研究目的1.建立DN大鼠模型,观察DN进展过程中的肠道菌群改变,及其与肾损伤（蛋白尿和病理改变）的相关性,寻找可能参与发病的关键微生物;2.肉桂醛治疗DN大鼠,观察其对肾损伤和肠道菌群的影响,并初步观察其可能的作用机制。研究方法1.DN大鼠模型构建及肉桂醛干预同周龄、血糖、体重相匹配的大鼠,随机分成4组,16只/组:（1）糖尿病肾病（DN）组:通过注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）构建DN大鼠模型,72h后,测定空腹血糖≥16.7mmol/L者确定纳入DN组;（2）对照（Normal Control,NC）组:注射等量1%柠檬酸钠缓冲液,72h后空腹血糖<7mmol/L者确定纳入NC组;（3）DN+肉桂醛（DNC）组:建模同DN组,第4天开始每天肉桂醛灌胃;（4）NC+肉桂醛（NCC）组:建模NC组,第4天开始每天肉桂醛灌胃。0d、4周、8周、12周为观察时间点,监测血糖、体重、24h尿蛋白（24-hour Urinary Protein,24hUP）,24h尿量（24-hour Urinary Volume,24hUV）,留新鲜粪便。分别在建模8周后（8只/组,分别为NC8、DN8、NCC8、DNC8 组）、12周后（8只/组,分别为NC12、DN12、NCC12、DNC12组）处死,留取血、肾组织标本。通过HE、PAS、Masson染色及电镜评估肾病理损伤。2.肠道菌群16s rDNA测序通过可操作性分类单位（Operational Taxonomic Units,OTU）聚类分析各组间共有和特有的OUT。α多样性分析:Chao1指数和ACE指数评估群落丰富度,Shannon指数和Simpson指数评估群落多样性。β多样性分析:计算Weighted Unifrac距离,并行降纬主坐标分析（Principal Co-ordinates Analysis,PCoA）。用 Metastats 和线性判别分析（Linear Discriminant Analysis,LDA）方法分析组间差异物种。用Spearman进行肠道菌群物种丰度与肾损伤指标的相关性分析。并通过Tax4Fun进行肠道菌群功能预测。3.肉桂醛改善DN机制探索通过免疫组化及半定量分析检测各组大鼠肾脏Megalin蛋白表达情况;通过Western Blot检测各组大鼠肾脏固有免疫通路IL22/IL17A,以及纤维化指标Fibronectin、TGF-β蛋白的表达。比较NC8与DN8组,DN8与DNC8组,NC8与NCC8组,组间蛋白表达量差异。4.统计方法计量数据使用Kolmogorov-Smirnov检验进行正态性检验。符合正态分布的计量数据以均值±标准差（mean±SD）表示,非正态的计量数据以中位数（四分位距）表示,即Median（Q25,Q75）。比较两组差异:对于正态分布,并且方差齐的计量数据,用t检验;对于非正态分布、方差不齐的计量数据,用非参数Mann-Whitney检验。双侧检验p<0.05为具有统计学差异。研究结果一、DN大鼠肠道菌群改变特点1.建立DN大鼠模型与对照组相比,STZ注射72h后,DN组大鼠血糖明显升高,且出现多饮、多尿、多食等表现。建模后第4周开始,与NC组相比,DN组体重显著降低（p<0.001）,血糖及24hUV均显著增高（p<0.001）。建模第8周开始,DN组24hUP显著高于NC组（p<0.001）,说明DN大鼠模型构建成功。建模8周后,DN组开始出现肾脏病理损伤,光镜下表现为肾小球增大,伴系膜细胞及基质增生;肾小管肿胀、管腔狭窄。电镜下可见肾小球基底膜增厚,足突融合;肾小管基底膜增厚、线粒体肿胀、部分刷状缘脱落。2.DN大鼠的肠道菌群特点肠道菌群结构:OTU分析示第8、12周的DN组共享764个OTU,特有的OTU分别为159个（17.2%）、218个（22.2%）,提示随着DN进展,肠道菌群种类会发生改变。与对照相比,DN8周的物种多样性、丰富度无明显改变;DN12周物种多样性,Simpson指数显著降低（0.95±0.01 vs 0.90±0.01,p<0.05）。β多样性分析提示,与NC8周与DN8周的组间差异相比,NC12周与DN12周的组间群落结构差异更大。差异物种:DN8周与同龄对照组间差异小,而DN12周与同龄对照组间差异大。Metastats分析显示,NC8周与DN8周之间,共1个门、1个纲、0个目、0个科、0个属、9个种存在显著差异（q<0.05）。NC12周与DN12周之间,共3个门、7个纲、10个目、18个科、19个属、14个种存在显著差异。而第8、12周的DN组间,共8个门、10个纲、10个目、16个科、39个属、30个种存在显著差异。说明随着DN进展,肠道菌群结构发生显著改变。其中,与同龄对照组相比,解纤维素拟杆菌（sBacteroides cellulosilyticus）与多形拟杆菌（sBacteroidesthetaiotaomicron）在DN8、DN12组均显著性降低。菌群相关性分析:有13个属、12个种的相对丰度与24hUP显著相关（p<0.05）,其中解纤维素拟杆菌（-0.39,p<0.01）、多形拟杆菌（-0.42,p<0.01）与24hUP显著负相关。肠道菌群功能:随着DN进展,肠道菌群功能发生显著改变。DNA修复和重组蛋白（DNArepairrecombinationproteins）、tRNA合成（TransferRNAbiogenesis）、嘌呤代谢（Purinemetabolism）等通路在DN12周显著富集。二、肉桂醛对早期DN的影响及机制初探1.肉桂醛对DN肾损伤的影响肉桂醛灌胃8周后,与DN8周相比,DNC8周的大鼠24hUP（86.65±10.08 vs 52.53±7.03 mg,p=0.02）、24hUV显著降低,血糖、体重无显著差异。灌胃12周,与DN12周相比,DNC12周大鼠24hUP、24hUV、血糖及体重均无统计学差异。光镜下,DN8周、DNC8周的大鼠肾病理损伤无显著差别。电镜下,与DN8周相比,DNC8 周的肾小管基底膜厚度显著降低（276.30±10.16 vs239.50±12.43 nm,p=0.02）,两组间肾小球基底膜厚度无显著差异。2.肉桂醛对DN大鼠肠道菌群的影响肠道菌群结构:肉桂醛干预使大鼠肠道菌群物种发生改变,DN8周与DNC8周共享774个OTU,特有的OTU分别为149个（16.1%）、247个（24.2%）。与DN8周相比,DNC8 周的 Simpson 指数显著降低（0.96±0.01 vs0.94±0.01,p<0.01）,提示肉桂醛会降低物种多样性,但不影响物种丰富度。通过PCoA分析直观显示,与NC8周、DN8周之间的距离相比,NC8周、DNC8周之间的距离更近;提示肉桂醛可能部分恢复DN大鼠的群落组成结构。差异物种:与DN8相比,DNC8中共1个门、2个纲、0个目、5个科、13个属、10个种的物种丰度存在显著差异。属水平,乳杆菌属（gLactobacillus）、拟普雷沃菌属（gA lloprevotella）、gOscillospira、gWeissella等益生菌在 DNC8 显著增加。种水平,与NC8周相比,共3个菌种在DN8周中降低,且经肉桂醛干预后,丰度恢复,包括马赛拟杆菌（sBacteroidesmassiliensis）,sOscillibacterspER4,sLachnospiraceae bacterium A2。p与NC8周相比,共2个菌种在DN8中升高,经肉桂醛干预后,丰度降低,包括 sRuminococcusspID1、sComamonas denitrificans。功能预测:肉桂醛干预使得DN大鼠的肠道菌群功能发生显著改变。与DN8周相比,转运子（Transporters）、嘌呤代谢（Purinemetabolism）、ABC转运子（ABCtransporters）等通路在 DNC8 周富集。3.肉桂醛改善早期DN的机制初探免疫组化及半定量分析显示,与NC8周相比,DN8周大鼠近端小管刷状缘的Megalin 表达显著减低（0.017±0.001 vs 0.006±0.001,p<0.01）;与 DN8 周相比,DNC8 周的 Megalin 表达显著恢复（0.006±0.001 vs 0.011±0.001,p<0.01）。与 NC8周相比,DN8周的肾脏纤粘蛋白FN表达显著升高（1.00±0.28 vs4.57±1.20,p=0.04）,肾脏IL22表达显著降低（1.00±0.12 vs 0.61±0.11,p=0.04）,两组间TGF-β无显著差异（p=0.08）。肉桂醛干预的 DNC8 周,FN（4.57±1.20vs0.68±0.06,p=0.03）、TGF-β（1.85 ± 0.37 vs 0.57 ± 0.15,p=0.03）蛋白的表达均较DN8周显著降低,但IL22（p=0.08）、IL17A（p=0.88）蛋白表达均无显著改变。结论本研究条件下:1.DN大鼠存在病程依赖的肠道菌群失调。与对照相比,建模12周后物种多样性显著降低,且组间差异物种增多,与24hUP显著相关;2.肉桂醛部分改善DN大鼠的肠道菌群失调,可增加乳杆菌属（gLactobacillus）、拟普雷沃菌属（gAlloprevotella）等抗炎益生菌的丰度;3.肉桂醛可降低DN大鼠早期蛋白尿,改善其肾小管基底膜增厚,并且可增加近端小管Megalin的表达,抑制肾脏FN、TGFβ,但不影响IL22、IL17A的表达。