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三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）是我国主要的海水养殖蟹类,其生长、蜕皮、发育及免疫易受水环境盐度变化的影响。渗透压调节是甲壳动物适应外界盐度变化的重要生理过程之一,其中鳃上皮细胞的离子跨膜转运是渗透压调节的主要途径。micro RNA（miRNA）是一类具有重要功能的非编码小分子RNA,能够从转录后水平调控靶基因的表达,在生物发育、分化以及抗逆过程中发挥重要功能。已有研究表明,miRNA可参与水生动物的渗透压调节,但相关研究在甲壳类中的报道较少。本研究拟从转录后水平研究三疣梭子蟹渗透压调节的分子机制:借助高通量测序技术高效发掘渗透调节相关miRNA,采用生物信息学方法预测miRNA靶基因,并从体内、外水平验证miRNA与其靶基因的调控关系。研究结果有助于系统解析三疣梭子蟹渗透压调节机制,可为耐低盐良种选育提供参考。本文的研究内容主要包括以下四个部分:一、低盐胁迫下三疣梭子蟹鳃组织miRNA的鉴定及分析利用高通量测序技术对低盐胁迫前后的鳃组织进行高通量测序分析,共检测到478个miRNA,其中已知miRNA 336个,新预测miRNA142个。差异分析结果显示,163个miRNA在低盐胁迫后显著差异表达,表明其可能在低盐适应中发挥一定的调节作用。进一步分析发现,差异表达的miRNA主要集中于低盐胁迫后的0～12h,且多数呈现上调表达的趋势。随机选择10个显著差异表达的miRNA进行定量分析,发现其表达趋势与测序方法检测的趋势一致,表明本研究miRNA高通量测序及分析结果可信度高。本章实验发掘了一批低盐胁迫后差异表达的miRNA,为深入探究miRNA在三疣梭子蟹低盐适应中的功能奠定了数据基础。二、离子转运相关miRNA及其靶基因的筛选和分析对上述发掘的miRNA进行靶基因预测,共获得有明确注释的靶基因7949个,其中包含2个与渗透压调节密切相关的离子转运基因—Na+/K+-ATPase和Na+/H+-exchanger。miRNA靶点预测结果显示,可结合其3’UTR的miRNA分别为miR-200137和miR-466f-3p。定量分析表明,Na+/K+-ATPase和Na+/H+-exchanger基因均在鳃和肝胰腺组织中高表达,显著高于其他组织（P<0.05）。相应的,miR-200137和miRNA-466f-3p也在鳃和肝胰腺组织中显著高表达,两者在组织分布上具有共同定位的趋势。进一步研究发现,低盐胁迫后,鳃组织中miR-200137和miR-466f-3p与其潜在靶基因Na+/K+-ATPase和Na+/H+-exchanger的表达趋势呈现明显的负相关（P<0.05）。以上结果初步证明了miR-200137和miRNA-466f-3p可能是调控Na+/K+-ATPase和Na+/H+-exchanger基因表达的重要因子。三、离子转运相关miRNA-靶基因的体外验证基于上述研究结果,我们进一步借助双荧光素酶实验,从细胞水平验证miR-200137和miR-466f-3p分别与其潜在靶基因Na+/K+-ATPase和Na+/H+-exchanger的调控关系。首先我们构建了Na+/K+-ATPase-3’UTR-wt（mut）、Na+/H+-exchanger-3’UTR-wt（mut）双荧光素酶表达载体以及不含荧光素酶的NC mimics、miRNA mimics（miR-200137和miR-466f-3p）表达载体,然后转染293T细胞。实验结果显示,仅在miR-200137与Na+/K+-ATPase-3’UTR-wt共转染时,荧光素酶表达量显著下调（P<0.001）,表明在体外细胞水平miR-200137能够直接抑制Na+/K+-ATPase基因的表达。同样的,miR-466f-3p与Na+/H+-exchanger的双荧光素酶实验结果显示,miR-466f-3p能够直接抑制Na+/H+-exchanger基因的表达。体外实验结果表明,2个miRNA在细胞水平可以直接抑制其靶基因的表达。四、离子转运相关miRNA-靶基因的体内验证在体外实验的基础上,我们尝试从体内水平再次验证miRNA与其潜在靶基因的关系。体内注射miRNA agomir后,miR-200137的表达持续上调,48h表达量达到峰值,为0h的528倍（P<0.05）。同时,Na+/K+-ATPase基因的表达及酶活性被显著抑制,分别在48h、24h表达量最低,与0h相比显著下调25倍和3.66倍（P<0.05）。同样,注射miRNA agomir也成功上调了miRNA-466f-3p的表达,在24h表达量最高,为0h的299倍（P<0.05）。相应的,Na+/H+-exchanger在注射48h后,与0h相比显著下调19.8倍（P<0.05）。此外,我们也检测了血淋巴的渗透压及离子浓度。发现注射miR-200137和miR-466f-3p agomir后,血淋巴渗透压及Na+、K+离子浓度均有所下降。上述结果证明了,miR-200137和miR-466f-3p在体内过表达,可抑制Na+/K+-ATPase和Na+/H+-exchanger的表达,从而影响其在三疣梭子蟹渗透压调节中的功能。