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棉纤维是重要的工业纺织原料,具有重要的经济价值。棉纤维的发育是从胚珠表皮细胞分化和突起的,其发育过程受多种基因的调控,并最终影响纤维的品质和产量。因此,从分子水平上阐明棉纤维初始发育的机理以及影响纤维品质和产量的主要因素,进而为分子育种改良棉纤维品质提供重要的理论依据。本研究利用NCBI数据库中公布的拟南芥同源基因contig16590,克隆了一个棉纤维发育的负向调控因子,并对其特征、功能及调控途径做了初步的分析；其中发现了一个重要的bHLH基因,并在雷蒙德氏棉中对bHLH家族进行了全基因组分析。取得的主要研究成果如下：MYB转录因子是植物转录因子家族中最大的家族之一,有着广泛的生理功能,几乎参与植物发育和代谢的各个方面。在模式植物拟南芥(Arabidopsis)中,已克隆多个MYB转录因子,并鉴定其和表皮毛(Trichome)发育相关。CPC是表皮毛发育的负向调控因子,与GL1竞争性结合bHLH,并抑制叶片表皮毛的发育。本研究选用3个无绒无絮突变体(XZ142 FLM、MD17、SL1-7-1)、2个无绒有絮突变体(N1N1、n2n2)和正常纤维TM-1在不同时期的胚珠或纤维对GhCPC进行表达分析；定量分析结果显示,GhCPC在TM-1的0、1、3 DPA胚珠和纤维中其表达量-明显低于无绒无絮和无绒有絮突变体的表达。GhCPC基因转化离体培养的胚珠,显著抑制纤维的生长；分析发现,其启动子受GA3的诱导,GA3处理转CPC基因的胚珠,其纤维素生长量显著低于对照组。GhCPC棉花转基因发现,CPC过量表达导致其转基因株系纤维长度显著变短；电镜扫描结果显示,阴性对照ODPA胚珠表面纤维正常突起,均匀分布；而转基因株系胚珠表面没有发现任何纤维突起,说明其纤维细胞的起始分化受到抑制；而1DPA胚珠表面纤维又开始生长,说明纤维发育滞后,但CPC的过量表达又并非完全抑制纤维的发育。而GhCPC的反义转基因株系无论0 DPA胚珠表面纤维突起还是成熟纤维长度均没有显著变化,同样,拟南芥CPC缺失突变体表皮毛也没有明显的表型变化。推测可能是由于棉纤维中同样存在类似于拟南芥中的ETC1、ETC2、TRY等功能相似的转录因子,功能上的互补弥补了GhCPC缺失造成的影响。由于GhCPC与AtCPC在氨基酸序列上的高度同源性,推测其可能拥有与拟南芥表皮毛相似的调控通路。定量分析调控通路中棉纤维的同源基因发现,GhCPC的高表达抑制了下游基因GhHOX3及GhRDL1的表达水平；推测,GhCPC可能也以MYB-bHLH-TTG1调控复合体的形式对下游基因的表达进行调控。为了揭示GhCPC对纤维发育的调控机制,本研究中以GhCPC作为诱饵,利用酵母双杂交技术进行棉纤维cDNA文库筛选。共转化结果显示GhCPC主要与一个bHLH基因(根据同源性命名为GhMYC1)具有很强的互作关系。同时,GhCPC分别与GhMYCl基因的N端(bHLH-MYC N domain)和C端(bHLH domain)共转化显示,GhCPC主要与bHLH基因的N端互作,与C端互作较弱。同时又以含WD40结构域的GhTTG1-GhTTG4构建诱饵与GhMYCl基因进行共转化,结果显示GhMYCl与GhTTGl和GhTTG4具有互作关系。利用酵母双杂交技术初步验证了GhCPC-GhMYC1-GhTTGl/4调控复合体的存在。复合体作为一个调控组合,其主要作用在于对下游基因的调控。在GhCPC棉花转基因株系中,GhCPC的过量表达导致GhHOX3及GhRDL1表达量的降低,推测GhCPC发挥其作用很可能是通过GhCPC-GhMYCl-GhTTG1/4复合体的形式对下游基因GhHOX3进行调控。利用酵母单杂交技术分析GhMYC1对GhHOX3启动子中E-box的调控作用,结果显示,GhMYC1能够结合E-box,并激活酵母体内AurR基因的表达,从而对AbA产生抗性。综合分析发现,本研究中发现的调控模型与拟南芥中的不完全相同。拟南芥中CPC的过量表达导致其叶片光滑无毛,但在棉花中无论是GhCPC过量表达转的基因棉花还是无绒无絮突变体中,除了纤维上的变化,叶片或茎杆表皮毛并没有明显的变化,同时也说明与基因的组织特异性无关。因此,我们推测在棉纤维和叶片(或茎杆)表皮毛的发育中存在两套独立的调控体系,拟南芥中调控表皮毛发育的复合体棉纤维的发育模型类似,但不适用于棉花叶片或茎杆表皮毛的发育。虽然本研究现在发现的复合体与拟南芥相似,但棉纤维的发育远比拟南芥表皮毛复杂得多,揭示两者之间的异同能够更进一步的阐释植物表皮毛发育的分子调控机理。GhMYCl是调控复合体中重要的组成部分。为了研究雷蒙德氏棉中bHLH家族其他成员的保守性和可能的功能,我们利用雷蒙德氏棉基因中的预测的177个bHLH蛋白和拟南芥中的127个bHLH蛋白共同构建进化树,从基因进化的保守性上分析未知蛋白可能的功能。聚类和进化树结果表明,bHLH家族基因在这两个物种中bHLH domain在进化中保持高度的保守性。GhMYCl与拟南芥AT5G41315.1 (GL3)进化关系最近,从进化的角度验证了GhMYCl的功能。因此,我们可以利用bHLH进化的保守性和拟南芥中bHLH基因的功能来推测雷蒙德氏棉中bHLH蛋白的可能功能,为下一步基因功能的研究提供依据。