本研究旨在研究酸马奶中筛选出的产蛋白类抑菌物质副干酪乳杆菌类坚韧亚种(Lactobacillus paracasei subsp.tolerans)对牛源致病性E.coli O8所致腹泻小鼠血清免疫、外周血免疫以及肠黏膜屏障作用机制,为其进一步深入开发研究益生菌类微生态制剂、医疗保健以及功能性食品提供理论依据。本研究分为以下三个试验:试验一:研究采用了琼脂扩散牛津杯法、有机酸排除试验、过氧化氢作用和蛋白酶敏感试验对分离出的54株乳酸菌进行初筛和复筛,通过微生物形态学、生理生化试验以及16S rDNA序列分析对试验菌株进行种属鉴定,并采用盐析法测定了菌株的最佳硫酸铵沉淀浓度。研究结果表明,分离出的54株乳酸菌中只有一株产生具有较强的抗菌作用的代谢产物,该菌的无细胞发酵上清液对蛋白酶K和胃蛋白酶敏感,抑菌活性完全丧失,从而确定抑菌物质为蛋白类。16S rDNA序列分析结果表明其属于副干酪乳杆菌类坚韧亚种,且该菌的最佳硫酸铵沉淀浓度为70%。试验二:通过注入致病性E.coli O8菌悬液制备小鼠腹泻模型,利用筛选出的副干酪乳杆菌进行干预。将体重为(20±2)g的70只SPF级昆明小鼠随机分为7组,每组10只。5组分别灌胃0.3 mL活菌数为1×106、1×108、1×1010 cfu/mL的乳酸菌菌悬液、0.1 g/mL的Nisin和0.15g/kg的盐酸环丙沙星,阴性对照组灌胃0.3mL生理盐水不进行治疗,正常对照组灌胃0.3 mL生理盐水。试验期为7天。采用ELISA法检测小鼠血清中细胞因子、体液免疫水平、抗氧化指标以及内分泌激素,并用流式细胞仪检测小鼠外周血中细胞免疫功能来评价副干酪乳杆菌的免疫调节作用。结果表明,与阴性对照组相比:①灌胃不同剂量乳酸菌能够促进小鼠生长性能(P<0.05)。②乳酸菌高剂量组可显著提高小鼠脾脏指数(P<0.05),对小鼠胸腺指数呈上升趋势,但差异不显著(P>0.05)。③乳酸菌组显著提高抗炎细胞因子IL-4、IL-10、TGF-β,降低促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17、IL-23、IFN-y,高剂量组最优。④乳酸菌组提高IgA、IgG、IgM含量,高剂量组分别提高了53.42%、33.64%、36.37%。⑤乳酸菌组提高CD19+ CD3+、CD4+比例,降低CD8+比例,并能够提高CD4+/CD8+二者的比值。⑥乳酸菌组可显著提高CAT、T-AOC、SOD和GSH-Px活力,显著降低MDA含量(P<0.05),且高剂量组效果最优。⑦乳酸菌高剂量组可显著降低GC含量(P<0.05),极显著降低ACTH含量(P<0.01),显著提高T3、T4、GH含量(P<0.05)。由此可知,乳酸菌能够促进小鼠生长性能和免疫器官发育,并能调节免疫和抗氧化指标,从而提高小鼠免疫力,同时调节内分泌激素,从而维持内环境的相对稳定,使机体处于健康状态。试验三:采用实时荧光定量PCR技术检测回肠黏膜TJ相关蛋白及细胞因子,并进行小鼠小肠组织HE染色后观察。用ELISA法检测小鼠血清中NO、DAO、D-乳酸、内毒素和回肠组织中sIgA含量和MPO活性。应用Illumina HiSeq高通量测序技术检测小鼠盲肠内容物中的菌群结构。结果表明:①与阴性对照组相比:乳酸菌组小鼠小肠绒毛长度显著提高(P<0.05),V/C值上升,乳酸菌组小鼠小肠绒毛缩短及形态受损有所恢复,高剂量组效果较明显;乳酸菌组血清中DAO、D-乳酸和内毒素显著降低(P<0.05);乳酸菌组OCCLUDIN、CLAUDIN-1、AM-A、Z0-1、Z0-2、Z0-3蛋白表达量显著提高(P<0.05)。②与阴性对照组相比:乳酸菌组NO含量、MPO基因表达量以及组织中MPO含量显著降低(P<0.05);乳酸菌组sIgA显著提高(P<0.05),COX-2、IL-6和TNF-α基因表达量下降。③在门水平上小鼠肠道优势菌群为拟杆菌门和厚壁菌门。抗生素降低小鼠肠道中厚壁菌门丰度,所占比例7.82%,而乳酸菌干预后厚壁菌门恢复至正常组水平,乳酸菌低、中、高剂量组的厚壁菌门比例分别为45.56%、66.38%、80.92%,因此,随着乳酸菌剂量的增加而拟杆菌门减少,厚壁菌门增多。正常组的变形菌门丰度为7.8%,阴性对照组为24.04%,其他组低于正常组。乳酸菌高剂量组的差异物种为乳酸杆菌门、乳杆菌目和杆菌纲。乳酸菌中剂量组的差异物种为毛螺菌科。乳酸菌高剂量组特有OTUs 42个,正常组特有OTUs 41个,抗生素组的特有OTUs最少。由此可知,乳酸菌干预能够提高腹泻小鼠肠道菌群多样性,用抗生素治疗导致下降肠道菌群多样性。乳酸菌提高肠道中正常菌群和有益菌,从而维持肠道微生态平衡。