论文部分内容阅读
聚苯乙烯型微米级微球不仅具有优良的化学和机械稳定性、易功能化、耐清洗和使用寿命长的优点,而且具有较高的分离效率,适宜作为高效液相色谱(HPLC)的分离材料,应用于药物和生化产品等物质的分离分析。国外已有学者对此开展了研究,国内研究尚属空白。
本文用国产高聚物型色谱柱取代进口色谱柱,研究其在有机酸发酵液、抗生素药物和多肽分离分析中的应用,为高聚物型填料在我国医药行业和生化领域下游分离纯化过程中的发展积累经验,具有重要的理论意义和实际的应用价值。
国产粒径单分散的聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)微球装填的麦科菲反相高效液相色谱柱(MKF-RP),克服了早期高聚物基质在有机相中溶胀,柱压陡增的缺点,而与硅胶基质的性能相似,在有机相中柱压呈有限的、规律性的变化。通过高效液相色谱分离5种芳香衍生物(苯酚、4-硝基苯甲醛、硝基苯、苯甲酸乙酯和甲苯),评价了该MKF-RP色谱柱的分离性能。通过优化得到最优的色谱分离条件:MKF-RP柱(250mm×4.6mmid.);流动相A液:水(20%),流动相B液:乙腈(80%);流速:0.6mL·min-1;温度:45℃;检测波长:254nmUV。在MKF-RP色谱柱上,苯酚进样量在0.2μg~40μg的范围内有着良好的线性关系(r=0.9999),重现性好,分析速度快且准确。
考查了以PS-DVB为基质的麦科菲有机酸柱(MKF-YJS)在流速为0~3mL·min-1之间时,柱压在0~250bar之间变化,柱压与流速呈现很好的线性关系,表明填料呈刚性且性状稳定。在MKF-YJS柱上,选择了5种常见的有机酸标准品(甲酸、L-乳酸、乙酸、琥珀酸和丙酸)进行色谱条件优化,得到最优分离条件:色谱柱:MKF-YJS(250mm×4.6mmi.d.,5μm);流动相:A:0.02mol·L-1NH4H2PO4(磷酸溶液调pH至2.5),B=乙腈,B=3%;流速:1.0 mL·min-1;温度:25℃;检测波长:210nm。5种有机酸谱峰都可达到基线分离,对称性在1.06-1.28之间,分离柱效均大于32000 Plates·m-1。在上述优化色谱条件下,MKF-YJS柱能够实现对琥珀酸发酵液中9种成分的快速检测。结果表明,在分离分析有机酸的应用中,MKF-YJS柱相比较于键合硅胶柱及进口有机酸柱,具有更优良的性能及性价比。在MKF-YJS柱上,琥珀酸进样量在1μg~240μg之间,线性良好(r=0.9999)。琥珀酸的RSD为0.628%。最低检测限和最大上样量分别为0.7μg和240μg。发酵液中琥珀酸平均回收率为91.76%。
参照国外药典,将MKF-RP色谱柱应用于土霉素药物的分离,克服了中国药典采用的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱所引起的色谱峰拖尾,柱效下降的缺点。通过优化得到最优色谱条件:色谱柱:MKF-RP(250mm×4.6mmi.d.);流动相:用200mL水,将45g2-甲基-2-丙醇移入1000mL的容量瓶中,再加入60mL、0.33mol-L-1的磷酸盐缓冲液(pH7.5),50mL、10g·L-1的四丁基硫酸氢铵(预先用稀NaOH溶液调节pH至7.5)和10mL、0.4g·L-1的乙二胺四乙酸钠(预先用稀NaOH溶液调节pH至7.5),并用水稀释至1000mL,过滤,脱气;流速:1.0mL·min-1;温度:60℃;检测波长:254nm。在优化的色谱条件下,土霉素供试品和土霉素标准品HPLC分离的各项参数均符合国外药典的要求,分离柱效大于3000。土霉素进样量在0.1μg~2μg之间,线性良好(r=0.9996),柱性能稳定。土霉素峰面积的RSD为0.13%。
采用高聚物型PS-DVB麦科菲反相高效液相色谱柱(MKF-RP-MH)分离胸腺素α1,这类疏水性基质表面不含键合的烷基官能团和残留的硅羟基,不易产生不可逆的非特性吸附作用,克服了常用C18键合硅胶柱分离多肽的负面影响。优化色谱条件为:流动相A:0.01mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH7.0或8.0),流动相B:乙腈,梯度洗脱条件0~20min,0%~10%B,20~40min,10%~30%B;温度:30℃;流速:0.8mL·min-1;检测波长:214nm。在优化条件下分离了胸腺素α1标准品和样品。样品浓度在0.05g·L-1~4g·L-1时,线性方程为C=0.0099A-0.0798(r=0.9994),胸腺素α最大载样量为120μg(6g·L-1)。