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背景/目的:卵巢癌是人类女性三大妇科恶性肿瘤之一,由于卵巢癌的发生一般无明显症状体征,约 70%患者最后发现时已处于癌症晚期,并伴随着腹膜转移和淋巴结转移,故卵巢癌居妇科恶性肿瘤死因的首位.80-90%原发性卵巢恶性肿瘤为卵巢上皮癌.目前,卵巢癌的主要治疗手段有手术减瘤、铂类+紫杉醇化疗、放疗,但是卵巢癌症晚期患者的 5 年存活率仍然很低.因此,我们有必要对卵巢癌的发病机制、有效的治疗靶点进行研究.SPOP 是E3泛素连接酶斑点型锌指结构蛋白(speckletype POZ protein),它能够特异性识别底物蛋白,使底物蛋白泛素化,并通过蛋白酶体途径降解,参与了多种生理、病理过程.Hh信号通路在包括卵巢癌在内的几乎所有肿瘤中都存在异常高度激活.本文就SPOP与Hh信号通路的关系以及SPOP对上皮性卵巢癌细胞的的作用机制进行了初步探讨.
方法:(1)用免疫组化方法检测人类正常卵巢组织和上皮性卵巢癌组织中SPOP蛋白表达情况,并根据SPOP在卵巢癌组织中表达情况和临床病理特征做相关性分析.
(2)构建过表达和敲低SPOP基因的慢病毒载体,转入到稳定表达SPOP蛋白的人类上皮性卵巢癌细胞株OVCAR-3中.用qRT-PCR和western blotting检测转染效率.
(3)用western blotting检测增殖细胞核抗原(PCNA),平板克隆形成实验和EDU实验检测稳定过表达和敲低SPOP的OVCAR-3细胞的增殖能力.
(4)用透射电镜观察过表达SPOP的OVCAR-3细胞株中凋亡小体,western blotting 检测过表达和敲低 SPOP 的 OVCAR-3 中凋亡相关蛋白(Bcl2、Bax、caspase3、cleaved-caspase3)的表达,从而检测SPOP对上皮性卵巢癌细胞的凋亡影响.
(5)用qRT-PCR和western blotting法检测过表达和敲低SPOP的OVCAR-3细胞株中,Hh 信号通路相关基因和蛋白(Gli1、Gli2、PTCH1、SuFu)的表达变化.
(6)用 Hh 信号通路 Gli1、Gli2 特异性抑制剂 GANT61 处理敲低 SPOP 的OVCAR-3细胞株,并用western blotting法检测Gli1和Gli2的变化.
(7)用流式细胞术检测GANT61处理后,SPOP敲低细胞株凋亡变化情况.
结果:(1)与人类正常卵巢上皮组织相比,上皮性卵巢癌组织中SPOP表达明显下调.在卵巢癌组织中,SPOP蛋白的表达量与患者的FIGO分期和病理等级呈负相关.
(2)在OVCAR-3细胞株中转染载有干扰SPOP表达的慢病毒之后,细胞的增殖能力相对于空载对照组细胞明显增强.相反,过表达SPOP的细胞增殖能力明显减弱.
(3)在OVCAR-3细胞株中转染载有SPOP过表达的慢病毒,会导致细胞出现凋亡.并且干扰 SPOP 表达后,凋亡相关蛋白中促凋亡蛋白( Bax、cleaved-caspase3)减少,抑制凋亡蛋白(Bcl2)增加.相反,转染了过表达SPOP的细胞株中,促凋亡蛋白增加,抑制凋亡蛋白减少.
(4)用qRT-PCR检测敲低SPOP的OVCAR-3细胞株中,Gli2基因表达增加, Gli1、PTCH1、SuFu变化不明显.但在过表达SPOP的OVCAR-3中,Gli2基因表达减少,Gli1、PTCH1、SuFu变化均不明显.
(5)用western blotting检测敲低SPOP的OVCAR-3细胞株中, Gli1、Gli2、SuFu蛋白表达增加,PTCH1变化不明显.相反在过表达SPOP的细胞中,Gli1、Gli2、SuFu蛋白表达减少,PTCH1变化不明显.
(6)用 Hh 信号通路 Gli1、Gli2 特异性抑制剂 GANT61 处理敲低 SPOP 的OVCAR-3细胞株, western blotting检测发现Gli1和Gli2蛋白表达降低.
(7)用流式细胞检测细胞凋亡.发现用GANT61处理敲低SPOP的OVCAR-3细胞株,相对于不加GANT61处理的细胞株来说,细胞的凋亡率有所增加.同时, SPOP敲低组的细胞株相对于空载对照组细胞,凋亡率明显减少.
结论:SPOP可以通过抑制Hh信号通路从而促进卵巢癌细胞OVCAR-3凋亡.但是,SPOP在卵巢癌中发挥抑癌作用的深入的机制还需要进一步研究.SPOP可以作为诊断治疗卵巢癌可能的潜在新靶点.
方法:(1)用免疫组化方法检测人类正常卵巢组织和上皮性卵巢癌组织中SPOP蛋白表达情况,并根据SPOP在卵巢癌组织中表达情况和临床病理特征做相关性分析.
(2)构建过表达和敲低SPOP基因的慢病毒载体,转入到稳定表达SPOP蛋白的人类上皮性卵巢癌细胞株OVCAR-3中.用qRT-PCR和western blotting检测转染效率.
(3)用western blotting检测增殖细胞核抗原(PCNA),平板克隆形成实验和EDU实验检测稳定过表达和敲低SPOP的OVCAR-3细胞的增殖能力.
(4)用透射电镜观察过表达SPOP的OVCAR-3细胞株中凋亡小体,western blotting 检测过表达和敲低 SPOP 的 OVCAR-3 中凋亡相关蛋白(Bcl2、Bax、caspase3、cleaved-caspase3)的表达,从而检测SPOP对上皮性卵巢癌细胞的凋亡影响.
(5)用qRT-PCR和western blotting法检测过表达和敲低SPOP的OVCAR-3细胞株中,Hh 信号通路相关基因和蛋白(Gli1、Gli2、PTCH1、SuFu)的表达变化.
(6)用 Hh 信号通路 Gli1、Gli2 特异性抑制剂 GANT61 处理敲低 SPOP 的OVCAR-3细胞株,并用western blotting法检测Gli1和Gli2的变化.
(7)用流式细胞术检测GANT61处理后,SPOP敲低细胞株凋亡变化情况.
结果:(1)与人类正常卵巢上皮组织相比,上皮性卵巢癌组织中SPOP表达明显下调.在卵巢癌组织中,SPOP蛋白的表达量与患者的FIGO分期和病理等级呈负相关.
(2)在OVCAR-3细胞株中转染载有干扰SPOP表达的慢病毒之后,细胞的增殖能力相对于空载对照组细胞明显增强.相反,过表达SPOP的细胞增殖能力明显减弱.
(3)在OVCAR-3细胞株中转染载有SPOP过表达的慢病毒,会导致细胞出现凋亡.并且干扰 SPOP 表达后,凋亡相关蛋白中促凋亡蛋白( Bax、cleaved-caspase3)减少,抑制凋亡蛋白(Bcl2)增加.相反,转染了过表达SPOP的细胞株中,促凋亡蛋白增加,抑制凋亡蛋白减少.
(4)用qRT-PCR检测敲低SPOP的OVCAR-3细胞株中,Gli2基因表达增加, Gli1、PTCH1、SuFu变化不明显.但在过表达SPOP的OVCAR-3中,Gli2基因表达减少,Gli1、PTCH1、SuFu变化均不明显.
(5)用western blotting检测敲低SPOP的OVCAR-3细胞株中, Gli1、Gli2、SuFu蛋白表达增加,PTCH1变化不明显.相反在过表达SPOP的细胞中,Gli1、Gli2、SuFu蛋白表达减少,PTCH1变化不明显.
(6)用 Hh 信号通路 Gli1、Gli2 特异性抑制剂 GANT61 处理敲低 SPOP 的OVCAR-3细胞株, western blotting检测发现Gli1和Gli2蛋白表达降低.
(7)用流式细胞检测细胞凋亡.发现用GANT61处理敲低SPOP的OVCAR-3细胞株,相对于不加GANT61处理的细胞株来说,细胞的凋亡率有所增加.同时, SPOP敲低组的细胞株相对于空载对照组细胞,凋亡率明显减少.
结论:SPOP可以通过抑制Hh信号通路从而促进卵巢癌细胞OVCAR-3凋亡.但是,SPOP在卵巢癌中发挥抑癌作用的深入的机制还需要进一步研究.SPOP可以作为诊断治疗卵巢癌可能的潜在新靶点.