【摘 要】
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目的:为提高那他霉素对真菌性角膜炎的治疗效果,通过将那他霉素和没食子酸接枝得到一种新型化合物没食子酸-那他霉素（Gallic acid-natamycin,GA-NAT）,进一步研究该化合物对烟曲霉菌性角膜炎的治疗作用。方法:1.通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）和紫外-可见光谱（UV-vis）实验检测没食子酸-那他霉素的结构表征特点。2.采用CCK-8实验和小鼠角膜Draize试验测定药物毒性。
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目的:为提高那他霉素对真菌性角膜炎的治疗效果,通过将那他霉素和没食子酸接枝得到一种新型化合物没食子酸-那他霉素（Gallic acid-natamycin,GA-NAT）,进一步研究该化合物对烟曲霉菌性角膜炎的治疗作用。方法:1.通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）和紫外-可见光谱（UV-vis）实验检测没食子酸-那他霉素的结构表征特点。2.采用CCK-8实验和小鼠角膜Draize试验测定药物毒性。3.通过MIC实验、粘附实验、生物膜形成、菌丝荧光白染色测定GA-NAT在体外对烟曲霉菌的抗真菌活性。4.建立小鼠烟曲霉菌性角膜炎模型,并用DMSO、那他霉素和GA-NAT以每日4次的频率对小鼠模型进行点眼治疗。在药物治疗后第3天和第5天,对小鼠模型的角膜炎症情况进行拍照和评分记录。5.采用免疫荧光和髓过氧化物酶测定实验评估小鼠模型的角膜感染组织中中性粒细胞的浸润。6.通过q RT-PCR实验检测真菌感染后第3天和第5天的小鼠角膜组织中模式识别受体LOX-1和下游炎症因子IL-1β和TNF-α的基因表达,进一步通过Western blot和ELISA实验验证角膜组织中相关炎性分子的蛋白表达。7.烟曲霉菌感染RAW264.7细胞,根据处理方式将其分为DMSO对照组、真菌感染组、那他霉素处理组和没食子酸-那他霉素处理组。细胞样品中模式识别受体LOX-1和下游炎症因子IL-1β、TNF-α的m RNA和蛋白表达通过q RT-PCR、Western blot和ELISA实验方法检测。结果:1.通过FT-IR和UV-vis实验证明是那他霉素和没食子酸成功接枝,生成GANAT。2.通过CCK-8实验发现GA-NAT在16μg/m L浓度内对HCECs和RAW264.7细胞无药物毒性,并且小鼠角膜Draize试验结果表明浓度为16μg/m L浓度内GA-NAT对小鼠角膜不产生损伤。3.通过MIC和菌丝染色实验发现浓度为8μg/m L的GA-NAT可以更好地抑制烟曲霉菌菌丝的生长,进一步通过生物膜实验和细胞粘附实验发现浓度为8μg/m L的GA-NAT可以抑制真菌生物膜的形成,还可以显著降低真菌孢子对细胞的粘附能力。4.角膜拍照记录以及临床评分实验发现烟曲霉菌性角膜炎小鼠角膜组织经过不同处理后,GA-NAT治疗组的小鼠角膜组织明显比DMSO对照组和那他霉素处理组预后效果好,角膜炎症程度显著减弱,同时GA-NAT治疗组的小鼠角膜组织的临床评分明显低于DMSO对照组和NAT处理组。5.平板计数实验显示GA-NAT治疗组的感染后第5天小鼠角膜组织中真菌存活量明显降低,并且低于DMSO对照组和NAT处理组。6.通过免疫荧光和MPO实验发现相较于DMSO对照组和那他霉素处理组,GA-NAT处理能够明显降低小鼠角膜的炎症反应,抑制中性粒细胞在炎症部位的募集以及下调髓过氧化物酶的表达。7.烟曲霉菌性角膜炎小鼠经GA-NAT治疗后小鼠角膜中模式识别受体LOX-1和下游炎症因子IL-1β、TNF-α的m RNA和蛋白表达相比DMSO对照组和那他霉素处理组明显降低。8.RAW264.7细胞经过烟曲霉菌刺激后,GA-NAT处理后的RAW264.7细胞中的模式识别受体LOX-1和下游促炎因子IL-1β、TNF-α的表达水平明显比DMSO对照组和那他霉素处理组低。结论:没食子酸-那他霉素是一种新型化合物,具有较低细胞毒性,对烟曲霉菌具有明显的抑菌作用,作用效果与那他霉素相当。在烟曲霉菌性角膜炎中,GA-NAT通过抑制真菌负荷、降低中性粒细胞侵袭、下调炎症因子的表达,发挥出良好抗炎活性。因此,GA-NAT为治疗真菌性角膜炎提供一种新选择。
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