家蚕BmMet基因的鉴定、克隆及功能分析

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在昆虫的生长、变态和生殖等发育过程中,蜕皮激素(Molting hormone,MH)和保幼激素(Juvenile hormone,JH)发挥了重要的调控作用。目前,MH调控昆虫生长发育的分子机制已经比较清楚,参与MH信号传导的受体和其他级联调控因子相继被鉴定,并建立了MH的级联信号传导网络。而有关JH的分子作用机制的研究报道则相对较少,参与JH信号传导的关键调控基因至今还未被确定。 Methoprene-tolerant(Met)基因最早在果蝇中被发现,编码一个bHLH-PAS型转录因子,具有典型的DNA结合结构域。已有研究报道,DmMet可以与JH主要种类即JHIII特异性结合并具有很高的亲和力,其突变体对JH产生抗性,过量表达DmMet则会增加果蝇对外源JH的敏感性,且能导致果蝇在幼虫期和蛹期死亡。另外,通过RNAi的方式将赤拟谷盗TcMet基因进行转录沉默后,不仅使赤拟谷盗产生了对JH的抗性,而且还引起了幼虫的早熟变态。表明Met基因在JH的调控过程中起了重要的作用,并由此推测Met可能是JH的候选受体。 家蚕是重要的经济昆虫和鳞翅目模式生物。近年来,研究者在家蚕发育的激素调控机理研究等方面,取得了诸多突破性进展。本研究基于家蚕基因组精细图、家蚕全基因组芯片表达数据、RACE技术和RNAi技术对家蚕可能的JH受体BmMet基因进行了全长cDNA克隆和基因干涉实验,初步探讨了BmMet基因的功能。获得的主要研究结果如下: 1.家蚕BmMet基因的全长cDNA克隆 通过生物信息学分析,我们在家蚕基因组精细图预测基因中鉴定了一个与果蝇DmMet基因有较高相似性的基因,并命名为BmMet。采用RACE-PCR的方法克隆获得了该基因的全长cDNA序列。BmMet基因cDNA全长为1917 bp,其中ORF有1368bp,编码455个氨基酸。5-UTR核苷酸为405bp,3-UTR核苷酸为144bp,并包含一个32bp的poly(A)尾巴。 2.家蚕BmMet基因的序列结构 通过染色体定位和基因组比较分析发现,该基因位于家蚕第8号染色体上,整个基因只有1个外显子,没有内含子,这与其他昆虫Met基因中的内含子数目不同,如黑腹果蝇中存在1个内含子、埃及伊蚊9个、<比亚按蚊7个、赤拟谷盗7个。通过在线SMART程序结构域预测显示,家蚕BmMet含有与其他昆虫Met一致的结构域,即bHLH、PAS-A、PAS-B和PAC,推测BmMet基因可能有与其他昆虫Met基因相类似的功能。 3.家蚕BmMet基因的时空表达特征 采用RT-PCR技术,我们分析了BmMet基因在家蚕不同发育时期个体和幼虫5龄第3天不同组织器官中的表达特征。结果表明,BmMet基因在家蚕整个发育时期都有持续的表达,在幼虫5龄第3天的各个组织器官中也都有表达,这与家蚕体内JH滴度的有规律变化没有明显相关性,推测BmMet基因的表达并没有受到JH的诱导调节。 4.家蚕BmMet基因功能的RNAi分析 通过dsRNA介导的RNAi实验,我们对家蚕BmMet基因的功能进行了初探。在幼虫4龄起蚕将BmMet基因转录沉默后,结果发现,并没有影响家蚕的正常发育,家蚕可以正常地蜕去4龄旧表皮而进入5龄,并正常地化蛹、化蛾。这与赤拟谷盗中TcMet基因的干涉效果不同,而与果蝇中DmMet基因缺失后无明显表型相类似,暗示Met基因在家蚕和果蝇中与其在赤拟谷盗中的作用方式不同。 综上所述,本研究在家蚕基因组中鉴定并克隆了Met基因的全长cDNA序列,发现家蚕BmMet基因同其他昆虫Met基因在序列结构上非常保守,而在JH信号通路中的作用方式却表现出差异。这些结果将为进一步研究BmMet基因在家蚕中的功能奠定基础。
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