论文部分内容阅读
蓝藻水华及其次级代谢产物微囊藻毒素(microcystins,MCs)不仅对水生生物有强烈致毒作用,甚至也会对人类产生严重危害。MCs有200多种变体,其中microcystin-LR(MC-LR)是研究最多,毒性最强的变体。研究表明,MC-LR对雌鱼有生殖毒性且主要表现为雌鱼体内的激素水平紊乱。此外,相关研究还表明,MC-LR影响卵母细胞的成熟和凋亡进程。然而,MC-LR干扰卵母细胞成熟和凋亡的潜在机制仍不清楚。为探究MC-LR通过干扰卵母细胞成熟和凋亡进程对雌鱼发挥生殖毒性的内在机制,本研究从亲本、卵母细胞、子代三个层面,卵母细胞质量(成熟)和数量(凋亡)两个方面设计实验,更加全面系统地探究MC-LR对鱼类的生殖毒性作用,为评估MC-LR的毒性效应提供实验依据。在本研究中,成年雌性斑马鱼于MC-LR(0,1,5,20μg/L)暴露30 d。暴露实验结束后,收集被暴露雌性和健康雄性斑马鱼繁殖产生的受精卵,并在无MC-LR的清水中孵育96 h。通过研究卵巢组织的形态学变化、卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)率以及卵母细胞成熟相关蛋白水平,揭示MC-LR对斑马鱼卵母细胞成熟的影响。另一方面,检测卵巢和子代内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)相关基因和蛋白的表达量,系统探究MC-LR对卵母细胞内质网应激及凋亡的影响和MC-LR通过母体传递对子代的毒性作用。主要结果如下:1.性成熟雌性斑马鱼于MC-LR(0,1,5,20μg/L)暴露30 d后,卵巢组织形态学观察显示,MC-LR暴露后卵巢发生病理性损伤,其主要特征是细胞间隙增大,卵母细胞滤泡细胞脱离以及实质组织的空泡化。20μg/L MC-LR处理导致斑马鱼卵母细胞GVBD率显著增加,环状单磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)和卵黄蛋白原(vitellogenin,VTG)的含量显著降低。此外,暴露于5和20μg/L MC-LR的斑马鱼卵巢中细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases,ERK)的磷酸化水平显著升高,而在20μg/L MC-LR中,细胞周期蛋白B(cyclin B)的磷酸化水平也明显上调。然而,MC-LR暴露未引起斑马鱼卵巢c AMP依赖性蛋白激酶(c AMP-dependent protein kinase,PKA)蛋白水平和cdc2磷酸化水平的显著变化。斑马鱼经过5和20μg/L MC-LR处理后产卵量显著降低,而且子代的畸形率显著升高。总之,本研究证明MC-LR通过激活ERK1/2和促成熟因子(maturation promoting factor,MPF)信号通路促进卵母细胞成熟,而c AMP参与其中。2.在本研究中,实验处理如上述。实验数据表明,5和20μg/L的MC-LR暴露导致斑马鱼性腺体指数(GSI)显著下降。在所有MC-LR处理组中,斑马鱼卵巢eif2s1a和eif2ak3转录水平显著增加,并且atf4、atf6、bcl-2、hspa5、eif2s1a和eif2ak3的m RNA水平在子代中明显上调。雌性斑马鱼经过20μg/L MC-LR处理,卵巢中c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)的磷酸化水平和裂解的caspase3蛋白表达量明显升高,但在子代斑马鱼中则无明显变化。此外,TUNEL结果显示5和20μg/L MC-LR处理显著诱导斑马鱼卵巢中卵母细胞凋亡,而吖啶橙(acridine orange,AO)染色表明MC-LR未引起子代的异常细胞凋亡。简而言之,本研究表明MC-LR在斑马鱼卵巢和子代通过不同的ERS途径导致细胞凋亡,为理解MC-LR诱导的细胞凋亡影响提供了新的视角。总之,研究结果表明,MC-LR通过ERK-MPF信号通路影响斑马鱼卵母细胞成熟,另一方面,MC-LR通过内质网应激诱导斑马鱼卵母细胞凋亡。MC-LR对卵母细胞的毒性作用进而导致雌性斑马鱼卵巢组织受损、产卵量降低、子代死亡率和畸形率升高,从而对雌性斑马鱼发挥生殖毒性。