论文部分内容阅读
第一部分TWIST过表达及干扰稳定细胞系的构建目的：针对不同骨肉瘤细胞中TWIST的表达水平差异,分别构建稳定高表达TWIST基因和稳定干扰TWIST基因的骨肉瘤细胞系,用于后续的功能研究。方法：采用基因克隆构建TWIST真核表达载体pCDNA3.1(+)-TWIST,转染骨肉瘤细胞Saos-2细胞,G418筛选稳定表达细胞系,Western blot检测获得TWIST稳定高表达细胞系Saos-2-TWIST细胞；采用TWIST shRNA慢病毒感染骨肉瘤MG63细胞,嘌呤霉素筛选,Western blot检测获得稳定干扰TWIST的细胞系MG63-TWIST-shRNA。结果：分别采用限制性酶切分析、测序鉴定证实,成功构建了重组表达载体pCDNA3.1(+)-TWIST。分别经G418和嘌呤霉素筛选的细胞系,采用Western blot检测,Saos-2-TWIST细胞可稳定高表达TWIST,而MG63-TWIST-shRNA中有效抑制TWIST的表达,干扰率80%以上。结论：成功构建TWIST稳定高表达和稳定干扰细胞系,并经Western blot鉴定符合预期要求。图9幅,参考文献7篇。第二部分TWIST与ET-1及ETAR受体信号的相互作用对顺铂作用下的骨肉瘤细胞生存率的影响研究目的：探讨TWIST和ET-1/ETAR信号的相互作用对于骨肉瘤顺铂耐药性的影响及可能的作用机制。方法：1.分别采用Realtime PCR、Western blot、ELISA检测不同TWIST表达水平的骨肉瘤细胞中ET-1的表达情况,并检测P13K抑制剂LY294002对TWIST和ET-1表达的影响；2.Tunel检测TWIST稳定高表达和干扰细胞系在采用PI3K抑制剂LY294002和ETAR抑制剂BQ123处理后细胞对顺铂的凋亡率变化；Western blot检测骨肉瘤细胞在P13K抑制剂LY294002处理后p-AKT的表达水平。结果：1. Saos-2细胞高表达TWIST导致ET-1mRNA和蛋白表达水平显著降低,而MG63细胞中抑制TWIST表达后ET-1的表达上调；此外,PI3K抑制剂LY294002可致使骨肉瘤细胞中ET-1表达显著下调；2.TUNEL检测发现,Saos-2细胞中高表达TWIST将导致细胞对顺铂的凋亡率显著增加,而这一趋势可通过外源添加ET-1(100pM)蛋白而被扭转；此外,选择性ETAR抑制剂BQ123可以完全阻断ET-1的反调作用,而LY2904002可部分阻断这个效果；另一方面,MG63细胞中下调TWIST蛋白的表达显著降低了细胞凋亡率,而这一效应可被BQ123或者LY294002所抑制；3. Western blot检测结果显示,Saos-2细胞中高表达TWIST显著降低了磷酸化AKT(Ser473)的表达水平,而LY294002作用后,磷酸化AKT (Ser473)下降更为显著,而在MG63细胞中,下调TWIST后,磷酸化AKT (Ser473)的表达水平增加了至少2倍以上,而此变化可被LY294002的作用所阻断。结论：TWIST通过抑制PBK/Akt通路下调ET-1/ETAR信号,从而降低骨肉瘤细胞对顺铂的生存率,降低其耐药性。图6幅,参考文献15篇。第三部分miR-33a通过下调TWIST提高骨肉瘤细胞对顺铂的耐药性目的：筛选骨肉瘤化疗耐药患者中差异表达的]miRNAs,重点确定调控TWIST表达和骨肉瘤化疗耐药的miRNA。方法：1.miRNA芯片筛选骨肉瘤化疗耐药组和反应良好组肿瘤样本间差异表达的miRNA;2.采用双荧光素酶筛选并验证靶向干扰TWIST基因的miRNA;3.采用Realtime PCR和Western blot检测35例骨肉瘤化疗耐药患者和35例反应良好患者的骨肉瘤组织样本中miRNA-33a表达水平和TWIST的蛋白水平；4.骨肉瘤细胞Saso-2和MG63及其相应的TWIST稳定表达或干扰细胞系,分别转染miR-33a和抑制剂antagomir-33a, Western blot检测TWIST表达水平,TUNEL检测骨肉瘤细胞顺铂的凋亡率变化。结果：1.运用miRNA芯片筛选骨肉瘤样本中的差异miRNA,结果显示,骨肉瘤化疗耐药组与对照组相比,有25个差异miRNA,其中6个miRNA表达上调,9个miRNA表达下调；2.采用靶基因预测软件TargetScan并结合miRNA芯片分析的结果,筛选出靶向TWIST基因12个候选的miRNA,双荧光素酶显示miR-33a可靶向干扰TWIST基因的表达；3. Realtime PCR和Western blot检测结果相关性分析显示,骨肉瘤组织中miR-33a表达水平与TWIST蛋白水平呈现负相关(r=-0.627, p<0.001)。 miR-33a与肿瘤坏死率负相关(r=-0.352,p<0.001),而TWIST蛋白水平与肿瘤坏死率呈正相关(r=0.562,p<0.001);4. Tunel结果显示,顺铂作用的Saos-2细胞中转染antagomir-33a抑制miR-33a表达后可显著增加细胞凋亡率,且高表达的Saos-2-TWIST细胞中转染antagomir-33a,其细胞凋亡率增长更为显著；而TWIST过表达导致的细胞凋亡率增高的作用,可被细胞中高表达miR-33a所逆转；MG63细胞中高表达miR-33a可显著降低顺铂诱导的细胞凋亡率,且在稳定干扰的MG63-TWIST-shRNA细胞上高表达miR33a,其细胞凋亡率下降更为显著；antagomir-33a抑制mir-33a表达后可显著增加顺铂诱导的细胞凋亡率,而干扰TWIST表达后这一现象可被逆转。结论：miR-33a通过下调TWIST增强骨肉瘤细胞对顺铂的耐药性,提示抑制miR-33a/TWIST信号可能是增强骨肉瘤新辅助化疗疗效一个潜在的新策略。图8幅,表3个,参考文献13篇。