乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)被公认为在肝癌发生与发展中扮演者着重要的角色。近年以来，乙肝病毒中各种突变体的发现被不断报道。本实验室之前的研究成果表明，乙型肝炎病毒X蛋白突变体Δ127X蛋白(HBxΔ127)具有促进肝癌病毒复制以及增殖的功能，其可与多种不同癌基因发生作用，进而影响细胞内多条相关的生存或凋亡路径。MicroRNAs(miRNAs)最早被报道发现于真核细胞，其是具有调控功能的一类非编码RNA，研究表明miRNAs在多种癌症的发生与发展过程中均异常表达，在癌细胞的增殖与调控方面发挥着重要的作用。miR-215是一种在肝癌中高表达的非编码RNA，但其具体的分子作用机制尚不清楚。为了进一步阐明HBxΔ127在促进肝癌发生与发展过程中的详细分子机制，本文探讨了miR-215在HBxΔ127促进肝癌细胞增殖中的作用及与之相关的分子机制。主要研究包括:　　 第一部分:HBxΔ127上调miR-215的表达水平　　 首先，在人类永生肝癌细胞系HepG2和H7402中瞬时转染HBx和HBxΔ127，且转染量分别呈剂量依赖，然后采用Real-time PCR的实验方法分别检测两组细胞系中miR-215的表达水平，Real-time PCR结果显示，与对照组相比，两组细胞系中Δ127X组的miR-215表达水平最高，而且呈剂量依赖性;为了深入研究HBxΔ127上调miR-215的相关机制，通过Real-time PCR检测了转基因鼠(0，6m，12m)中miR-215的表达水平，结果表明与对照组相比，12个月的老鼠中miR-215的表达含量明显上调。因此，HBxΔ127可以上调miR-215的表达水平。　　 第二部分:MiR-215促进肝癌细胞增殖及迁移　　 miR-215对肝癌细胞的调控作用尚不明确。为了验证HBxΔ127是否通过miR-215促进肝癌的发生与发展，在肝癌细胞系HepG2细胞系中瞬时转染miR-215，通过MTT的实验方法检测其对HepG2细胞增殖的影响。结果显示，与对照组相比，miR-215过表达的实验组对细胞的增殖与生长具有非常显而易见的促进作用，并且表现出明显的时间依赖性;为了进一步验证上述结论，在肝癌细胞系HepG2-Δ127中干扰miR-215的表达，肝癌细胞的增殖则明显被抑制;划痕实验结果显示，在肝癌细胞系HepG2细胞系中瞬时转染miR-215后，与对照组相比，过表达miR-215的肝癌细胞组迁移能力明显增强;反之，在HepG2-Δ127中干扰miR-215的表达，结果显示，干扰miR-215后的肝癌细胞HepG2-Δ127的迁移能力明显下调;动物成瘤的实验结果显示，当HepG2-Δ127中的miR-215被干扰后，老鼠的成瘤能力明显被抑制。综上所述，在体外细胞试验和体内动物试验中，miR-215均具有促进肝癌细胞增殖的能力。　　 第三部分:MiR-215下调蛋白酪氨酸磷酸酶受体T（PTPRT）的表达水平　　 首先，利用GenBank软件预测出miR-215的靶基因为抑癌基因蛋白酪氨酸磷酸酶受体T(PTPRT)。然后，在肝癌细胞系HepG2细胞系中瞬时转染miR-215，运用RT的实验方法检测PTPRT的表达水平，实验结果表明，与对照组相比，随着miR-215转染量的逐步上调，PTPRT的表达量呈逐步下调的情况，且呈现剂量依赖性;在肝癌细胞系HBxΔ127细胞系中瞬时转染anti-miR-215，然后运用RT的实验方法检测PTPRT的表达水平，实验结表明，随着anti-miR-215转染量的逐步上调，PTPRT的表达量呈逐步上调的情况，且呈剂量依赖性。以上实验结果显示，miR-215可以抑制PTPRT的表达。　　 第四部分:MiR-215和PTPRT在HBxΔ127促进肝癌细胞增殖中的作用　　 首先，我们利用GenBank和MatInspector等软件预测出miR-215的启动子区域，且初步预测出其可能靶向的目的基因为PTPRT基因。然后，利用Prime5.0设计出miR-215的启动子区域的PCR扩增引物，并且以H7402细胞系的基因组作为模板，将扩增产物克隆至荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic上，最终进行测序以挑选出连接成功的阳性克隆体。另一方面，利用Prime5.0设计出PTPRT基因的3-UTR端引物，以正常细胞系LO2细胞系所得的cDNA作为模板，将扩增片段克隆至载体pGL3-Control上，最终进行测序鉴定并选出连接成功的阳性克隆。在肝癌细胞系HepG2细胞系中，双荧光素酶报告基因的实验结果表明，与对照组相比，过表达miR-215实验组中PTPRT的启动子活性明显被下调，且呈剂量依赖性;相反，在HBxΔ127细胞系中，双荧光素酶报告基因的实验结果表明，与对照组相比，anti-miR-215实验组中PTPRT的启动子活性明显被上调。综上所述，miR-215可以下调蛋白酪氨酸磷酸酶受体T（PTPRT）的表达水平。　　 综上所述，该研究表明，HBxΔ127通过上调miR-215的表达水平，而后下调蛋白酪氨酸磷酸酶受体T（PTPRT）的表达进而实现其促进肝癌细胞增殖的功能和作用。该研究有助于进一步深入揭示HBxΔ127促进肝癌发生和发展的分子机制，对治疗肝癌具有重要的参考价值。