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透明质酸酶(Hyaluronidases,HAases)是一种糖苷酶,能够降解大分子透明质酸(Hyalurinan,HA)生成低分子量的透明质酸寡糖,主要来源于哺乳动物、昆虫、水蛭、病原真菌及细菌,广泛应用于食品与医药行业。目前商品化的HAase主要从牛睾丸中提取而来,提取步骤繁琐,杂蛋白多,纯度低,且存在免疫原性导致治疗的危险性增大。来源于水蛭的HAase在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的成功表达解决了上述问题,因此运用基因工程技术制备无潜在动物交叉感染的水蛭HAase已成为当今研究的热点。本研究选用的表达宿主为P.pastoris GS115,为进一步提高HAase的产量,通过信号肽的筛选,HAase编码基因LHyal的N端融合双亲短肽(Amphipathic peptides,APs),以及在3 L发酵罐上研究诱导温度对HAase表达的影响,使HAase高效表达,以期早日实现水蛭HAase的产业化。本论文研究的主要结论如下:(1)使用信号肽ns B提高HAase的分泌表达将质粒p PIC9K-LHyal的信号肽α-factor分别替换成信号肽HKR1,YTP1,SCS3和ns B,获得含不同信号肽的重组菌株。摇瓶发酵培养,重组菌株GS115-ns B-LHyal的胞外酶活最高且为7.96×104 U·m L-1,比重组菌株GS115-LHyal(信号肽为α-factor)发酵酶活提高了26.0%,说明信号肽ns B更适合HAase的分泌表达。在3 L发酵罐中进行补料分批发酵,产量为1.03×106 U·m L-1,是摇瓶产量的12.9倍。(2)LHyal基因的N端融合短肽AP2促进HAase的分泌表达在信号肽ns B的基础上,LHyal基因的N端融合6种不同的APs,获得不同短肽重组菌株。重组菌株GS115-ns B-AP2-LHyal胞外酶活最高且为9.67×104 U·m L-1(摇瓶水平),比重组菌株GS115-ns B-LHyal发酵酶活提高了21.7%。经SDS-PAGE蛋白电泳分析,融合短肽AP2菌株发酵上清液中目的蛋白含量比重组菌株GS115-ns B-LHyal发酵产目的蛋白含量高,说明短肽AP2能促进HAase的分泌表达。(3)融合蛋白AP2-HAase的酶学性质分析为进一步研究融合短肽AP2对HAase的影响,分析其酶学性质及酶动力学参数的变化。融合蛋白AP2-HAase经镍柱纯化后,最适反应温度由45°C提高为50°C,且热稳定性有小幅度的提高,最适反应p H值由6.5降为5.5,在p H值3.0-8.0保持稳定,比酶活为1.44×106 U·mg-1,酶动力学常数Km值降低,kcat/Km值增大,这表明融合短肽AP2能够提高HAase的催化效率。(4)阶段控温策略提高HAase的分泌表达不同诱导温度下菌体浓度均能达到190.0 g·L-1左右,温度为22°C时HAase的产量最高且为1.48×106 U·m L-1。基于对细胞活力与醇氧化酶(Alcohol oxidase,AOX)活力的研究,确定诱导阶段采用阶段控温策略即在诱导阶段1-60 h,温度控制在25°C,60 h后,温度控制在22°C,HAase的产量高达1.68×106 U·m L-1,为温度30°C时发酵最高产量的3.5倍,这是目前已报道的重组毕赤酵母中表达HAase的最高产量。