低pH孵放法灭活生物制品中慢嗜性小鼠白血病病毒的方法学研究

来源 :中国中医科学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:chunxi1208
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生物制品包括血液制品、基因制品、病毒类疫苗等,为了提高生物制品临床使用的安全性,生产工艺要具有一定的去除或灭活部分病毒的能力,生产过程中应有特定的去除或灭活病毒的方法。重组融合蛋白属于基因制品的一种,目前上市销售的重组融合蛋白类生物制品包括TNF-α、IFN-γ、IL-18、IL-12等,此类蛋白主要以中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)作为表达载体。目前,CHO细胞表达抗体药物已经产业化。然而,CHO细胞内本身存在内源性逆转录病毒,这一结论已经得到证实;但这种内源性逆转录病毒对人类不具有致病性。尽管这种内源性逆转录病毒对于人类是非致病性的,但采用CHO细胞作为药用蛋白质的表达载体,其分泌的蛋白质对于人用药的安全性仍然具有的一定潜在风险。因此,各国新药研发相关法规要求对于CHO细胞来源的药用蛋白质,其生产工艺中必须具备病毒去除或灭活工艺,而且,必须对该工艺在实验室进行病毒去除或灭活的验证检验。我国相关生物制品生产厂家及生产品种逐年增多,但实验室验证研究的方法国内目前尚未建立,需在美国进行试验,因而时间长、费用高成为制约国内相关新药研发的关键问题。本课题根据SFDA相关法规和技术要求,建立此类蛋白药物的病毒灭活验证方法,以填补国内空白。   此外,本课题中建立的异嗜性小鼠白血病病毒(X-MulV)致猫神经星形胶质细胞(PG-4)产生病变效应的体外模型,不仅可以用于生物制品中病毒灭活验证检验,亦可用于抗逆转录病毒新药的筛选及药效学评价。   美国FDA及我国SFDA要求:对于CHO细胞来源的重组蛋白在低pH生产工艺的验证性试验中,采用X-MulV作为CHO细胞内源性逆转录病毒的指示病毒(又称作模拟病毒、替代病毒),建立低pH孵放法病毒灭活验证方法。   本课题共分三个部分进行研究:   一、X-MulV体外培养及活性评价体系的建立   目前国外研究者采用Mus.Dunni细胞对X-MulV进行传代,由于该细胞株在国内即为少见,同时考虑到X-MulV能够在非小鼠细胞系生长的特点,我们选择以CHO细胞作为X-MulV的传代细胞,通过SYBR Green荧光定量聚合酶连反应(SYBR Green real-time PCR assay),以gag基因作为靶基因,定量X-MulV在CHO细胞中生长2~7天的相对表达量,并通过病毒感染性试验(PG-4细胞空斑试验)确定病毒数量显著增加时间点的病毒滴度。   结果显示:分别以培养时间作为横坐标、以指示病毒gag基因RNA的相对表达量作为纵坐标,绘制gag基因RNA相对表达量随时间变化的曲线。曲线显示:gag基因在CHO细胞中生长2~7天的生长曲线符合指数形式,指数方程拟合相关系数R2=0.9125,生长第7天的数量比第2天显著增长(p<0.01),是第2天的13.89倍。   经CHO细胞传代培养7天的X-MulV悬液,其在指示细胞PG-4上的病毒滴度为8.78±0.25 log10PFU/mL。病毒灭活方法指导原则中规定:作为指示病毒的病毒,其病毒滴度必须达到7.0 log10以上。   因此,以CHO细胞作为X-MulV的传代细胞,经培养7天得到的病毒悬液能够用于病毒灭活验证试验。   二、低pH法灭活生物制品中X-MulV方法的建立   1.缓冲体系的建立:在灭活验证试验中,模拟重组蛋白质的生产工艺,以Tris-碱-柠檬酸缓冲液体系作为样本缓冲液,将样本缓冲液与X-MulV储备液以9∶1体积比混匀后,进行病毒灭活验证试验。   2.检测指标:以病毒滴度作为检测指标,当降低的病毒滴度大于4.0 log10PFU视为有效灭活。   3.灭活参数考察:包括pH值、灭活温度、灭活时间以及蛋白质浓度对灭活效果的影响。灭活试验中设置不同因素、不同水平参数如下:灭活pH值:3.00、3.50、4.00以及5.00;灭活温度:4℃、10℃、20℃以及25℃;灭活时间:2h、4h、6h、8h以及10h;蛋白质浓度(以卵清白蛋白作为模拟蛋白,OVA):0 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL、4.0 mg/mL、5.0 mg/mL、6.0 mg/mL、7.0 mg/mL、8.0 mg/mL、9.0 mg/mL以及10.0 mg/mL。将不同因素、不同水平按照排列组合的方式组合后,分别进行病毒灭活验证试验。   对所有得到的残余病毒滴度进行统计学分析,通过正交分析主成分分析得出:不同因素对病毒滴度的影响大小依次是:pH>温度>时间;pH值和温度对病毒滴度有显著的影响(p<0.01),时间不具有显著性影响(p=0.264);通过正交分析交互作用分析得出:温度和时间之间的交互作用对病毒滴度具有显著性影响(p=0.016);通过正交分析筛选出的最优灭活条件为:pH3.50、4℃、4h。多元线性回归分析显示:pH值能够显著影响病毒滴度(p<0.01),温度能够影响病毒滴度,但影响不具有显著性(p=0.081),时间对病毒滴度没有影响(p=0.941)。结合上述分析结果,同时考虑到实际灭活工艺在常温条件下进行;因此,在考察蛋白质浓度对病毒滴度的影响时,在pH3.50、4h一致的前提下,同时考察4℃和25℃的灭活效度。经灭活后,蛋白质浓度从0 mg/mL~10.0 mg/mL范围内,4℃组和25℃组病毒滴度降低分别大于4.1 log10PFU和4.7 log10PFU;且25℃组样本病毒降低滴度基本大于5.0 log10PFU。   在此基础上,进行pH值、温度及时间因素允许范围的考察。通过病毒感染性试验,当灭活温度为25℃、孵育4h时,pH值在3.60~3.90范围内,X-MulV病毒滴度降低均大于5.0 log10PFU;当pH为3.60、孵育4h时,温度在23℃、24℃、25℃、26℃以及27℃范围时,X-MulV病毒滴度降低均大于5.0 log10PFU;当pH值为3.60、孵育温度为25℃时,灭活0~180 min不能有效灭活X-MulV,灭活240 min能够有效灭活X-MulV。通过参数允许变化范围的考察,结合相关文献报道:pH3.50时,生物制品会有少量损失。我们将最优灭活条件设为:pH3.60、25℃及4h。   4.逆转录酶活性检测:为了进一步评价灭活效度,采用产物增强的逆转录酶反应法(简称为PERT法)考察X-MulV灭活前后逆转录酶活性的变化。结果显示:以MMLV作为已知浓度的标准逆转录酶,通过逆转录酶浓度-CT值标准曲线,计算样本中逆转录酶的含量。经SYBR Green荧光定量PCR反应检测逆转录酶活性,经pH3.50、4h灭活后,逆转录酶含量比未灭活样本降低两个数量级,具有显著性差异(p<0.01),且4℃组与25℃组之间没有显著性差异(p>0.05)。   5.低pH对生物制品活性的影响:选择L929细胞株作为靶细胞,采用MTT比色法检测rhTNF-α的对L929细胞的杀伤活性。将rhTNF-α经pH3.60、25℃孵育4h后,其杀伤L929细胞活性与中性rhTNF-α相比,未发生变化。   6.低pH对病毒包膜基因的影响:利用传统聚合酶链式反应,考察X-MulV在有效灭活前后,包膜基因env3末端1626~1930位点片段的扩增情况。X-MulV经pH3.60、25℃灭活4h后,env3末端305 bp片段未扩增出,而阳性对照中该片段条带清晰,且亮度高。   三、试验方法的实际应用   采用pH3.60、25℃、4h的灭活条件对百奥泰(广州)生物科技有限公司提供的注射用rhTNF-α融合蛋白进行X-MulV的灭活验证,结果显示病毒滴度降低4.0 log10以上,说明此条件能够有效灭活指示病毒X-MulV,符合国际规定的病毒滴度降低大于4.0 log10的要求。   通过以上研究,我们得出结论:   1.以CHO细胞作为X-MulV的传代载体,培养7天,获得的X-MulV病毒悬液,在PG-4细胞中的病毒滴度能够达到7.0 log10PFU以上,符合生物制品病毒灭活指导原则关于指示病毒的要求;   2.采用pH3.60、25℃、4h灭活CHO细胞来源的人重组融合TNF-α蛋白药物中指示病毒X-MulV,能够实现有效灭活,其病毒滴度降低大于4.0log10PFU,说明通过本研究建立的验证性试验方法可行;   3.此灭活条件对所检测样品的生物学活性无影响;   4.低pH影响包膜基因env3末端1626~1930位点,X-MulV能够被有效灭活可能与该位点有关。
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