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家蚕(Bombyx mori)是具有5000多年饲养驯化历史的重要产丝昆虫。丝腺是家蚕合成和分泌蚕丝蛋白的专一器官,通常分为前部丝腺、中部丝腺和后部丝腺三个形态功能各异的部分,其中中部丝腺和后部丝腺分别合成并分泌丝胶(约占25%)和丝素(约占75%),二者是蚕丝的主要成分。丝腺对蚕丝产量和品质具有决定性作用,是蚕丝业的生物学基础。丝素蛋白由三个亚单元即丝素重链(fibH)、丝素轻链(fib L)和糖蛋白P25组成,三者以6:6:1的比例组装形成一个基本结构单元。丝胶蛋白的组分较为复杂,至少包括丝胶1(Ser1)、丝胶2(Ser2)、丝胶3(Ser3)等几种蛋白组分。据早期线索,丝蛋白合成调控主要发生在转录水平,即激素信号首先传导至转录因子,再由转录因子直接调控丝素和丝胶蛋白编码基因(主要作用于启动子区,亦可作用于内含子区),对这些基因进行时空特异的“开启”或“关闭”,从而指导蚕丝蛋白高效受控合成,该调控过程错综复杂。近几十年来,国内外学者围绕丝蛋白的合成调控开展了大量研究并有丰富进展,但至今仍未探明其详细机制。启动子是基因受控表达的核心功能元件。研究丝素和丝胶蛋白编码基因启动子的表达调控特征,有助于揭示蚕丝蛋白合成调控的分子机制。本论文以五个编码主要丝蛋白组分的基因启动子(fibH、fibL、Ser1、Ser2、Ser3)为靶标,利用改造优化的GAL4/UAS双元表达工具,通过制作相应的转基因家蚕,在个体水平上详细分析五个启动子的时空表达特征,取得了以下主要结果:1.GAL4/UAS转基因家蚕的制作(1)以在家蚕基因功能研究中常用的原始版GAL4/UAS系统为基础,分别对GAL4基因和UAS元件进行了改造优化,进而分别构建了以fibH、fibL、Ser1、Ser2、Ser3为启动子的GAL4转基因表达载体和以绿色荧光蛋白EGFP为报告基因的UAS转基因表达载体。(2)经显微注射多化性家蚕品系Nistari的早期胚胎,制作获得了相应的基础转基因系,分别命名为fibH-GAL4(HG4)、fibL-GAL4(LG4)、Ser1-GAL4(S1G4)、Ser2-GAL4(S2G4)、Ser3-GAL4(S3G4)和UAS-EGFP(UEGFP)。(3)将HG4、LG4、S1G4、S2G4、S3G4分别与UEGFP进行两两杂交,通过双荧光筛选,获得了相应的GAL4/UAS转基因杂交后代,分别命名为HG4/UEGFP、LG4/UEGFP、S1G4/UEGFP、S2G4/UEGFP和S3G4/UEGFP。分子检测结果证实,所有的GAL4/UAS转基因系制作成功,可用于下一步分析。2.丝素基因启动子的时空表达特征(1)fibH启动子的表达特征。首先,对五龄第6天HG4/UEGFP的主要组织进行了检测,发现EGFP在转基因家蚕的后部丝腺特异表达。进而,对胚胎第8天到蛹期第3天的转基因家蚕后部丝腺进行检测发现,EGFP在胚胎第8天即有明显表达,其表达一直持续至蛹期第3天,其中五龄第6天的表达水平相对最高。分子检测结果与荧光观察结果一致。(2)fibL启动子的表达特征。对LG4/UEGFP进行组织和时期检测发现,fibL启动子驱动EGFP表达的时空特征与fibH启动子高度相似,即EGFP特异表达于转基因家蚕后部丝腺,并且从胚胎第8天至蛹期第3天均有表达,五龄第6天是其表达高峰。分子检测结果与荧光观察结果一致。有趣的是,HG4/UEGFP和LG4/UEGFP的后部丝腺降解速度均比野生型家蚕(WT)后部丝腺延迟约1天,推测其与GAL4/UAS系统特别是GAL4的高表达有关,但还需研究确证。另外,早期文献报道fibH和fibL基因在龄期表达,眠期不表达。本研究发现,fibH和fibL启动子驱动的EGFP在4个眠期均有表达,表明fibH和fibL启动子在眠期仍有相当活性或者并未受到体内激素信号的完全抑制,该现象值得进一步探究。3.丝胶基因启动子的时空表达特征(1)Ser1启动子的表达特征。检测五龄第6天S1G4/UEGFP主要组织中的荧光蛋白表达特征发现,EGFP仅在转基因家蚕中部丝腺的中区和后区表达。进一步检测证实,自五龄第3天开始,EGFP在中部丝腺的中区和后区特异表达,其表达持续至预蛹期第2天,表达峰值出现在五龄第6天。分子检测结果与荧光观察结果一致。(2)Ser2启动子的表达特征。对五龄第6天S2G4/UEGFP转基因家蚕的主要组织进行检测发现,EGFP仅在中部丝腺的前区的前端表达。随后对三龄第2天至蛹期第4天的转基因家蚕中部丝腺进行检测,结果显示:四龄第1天到四龄眠,EGFP在中部丝腺的前区开始表达;五龄第1天到预蛹期第2天,EGFP在中部丝腺前区的前端表达。该结果首次在个体水平上揭示了Ser2启动子的时空表达特征。(3)Ser3启动子的表达特征。检测五龄第6天S3G4/UEGFP的主要组织发现,EGFP仅在转基因家蚕中部丝腺前区的后端表达。随后对五龄第1天至蛹期第4天的转基因家蚕中部丝腺进行检测发现,EGFP自五龄第6天开始在中部丝腺前区的后端开始表达,其表达一直持续至预蛹期第2天。分子检测结果与荧光观察结果一致。以上结果表明,Ser1、Ser2和Ser3启动子驱动的EGFP均在中部丝腺中特异表达,但它们的表达部位和表达时期具有明显差异,提示3个启动子的时空表达调控特征不同,反映了丝胶基因的受控表达和蛋白合成调控机制更为复杂,值得进一步研究揭示。综上,本研究通过在个体水平上详细分析由fibH、fibL、Ser1、Ser2、Ser3启动子驱动的EGFP的表达模式,探查了这五个主要的丝蛋白编码基因启动子的时空表达特征,为深入揭示丝蛋白合成调控机制提供了理论参考和转基因素材。