研究背景及目的白血病俗称血癌,是由于造血干祖细胞在遭受多次打击的情况下,导致造血干细胞恶性克隆性增殖、分化受阻和凋亡能力下降,进而引起大量不成熟原始幼稚细胞在骨髓及外周血中的异常聚集。白血病是一组异质性极强的造血系统恶性肿瘤,目前研究者们一致认为,白血病的发病多遵循“二次打击”学说。多数急性白血病AL(acute leukemia)的发生起源于多个基因同时或次序发生异常突变,I类突变通常认为受体络氨酸激酶(RTKs)的活性受到影响,进而赋予发生基因突变的造血细胞增殖和生存优势；II类突变认为在I类突变的基础上进而发生染色体异位、融合蛋白的形成导致造血转录因子功能异常,使不同阶段细胞的分化和凋亡能力受损,当两者同时出现异常时导致造血细胞恶性克隆性无限增殖、不能正常分化为晚期阶段细胞此时触发白血病的发生。由此可见转录因子在维持造血干细胞正常生物学特性方面起至关重要的作用。我们多年的临床实践发现一些临床现象：部分急性白血病患者初诊时细胞形态学及免疫学表型同时具有髓系及淋系的特征,甚至一些患者为急性混合细胞性白血病,个别患者疾病复发时白血病类型可能会发生转变,如初发时为急性淋巴细胞白血病,复发时有可能是急性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病也有可能表现为急性双表型白血病,慢性粒细胞白血病急变时可能变为急性髓系白血病,也可能为急性淋巴细胞白血病等等。目前关于上述疾病类型发生转变的一些原因及机制并不清楚,其中是否涉及造血调控及与白血病发病密切相关的转录因子有待于进一步研究。研究表明,转录因子C/EBPa和PU.1与正常造血调控、白血病发病关系密切,且表达水平的不同会导致细胞谱系的改变。转录因子CCAAT增强子结合蛋白A基因编码的转录因子CCAATA强子结合蛋白a(CEBPa)与正常造血调控、白血病发病密切相关。CEBPa基因位于19号染色体长臂(19q13.1),全长3318bp,序列中无内含子,是亮氨酸拉链转录因子家族(C/EBPs)中的一员,在造血过程中的作用主要有：抑制细胞增殖、诱导髓系细胞分化和抑制细胞凋亡。研究证实,C/EBPa在急性髓系细胞白血病(AML)通常表现为缺失、突变而在急性淋巴细胞白血病(ALL)中经常表现为异常高表达,也就是说在急性髓系白血病和急性淋巴细胞白血病的发病中分别起抑癌基因和原癌基因的作用,l其表达水平过高或者过低均可能导致白血病的发生,因此维持其表达水平的恰到好处对于维持造血发育的稳定起非常重要的作用。PU.1是Ets家族中的一员,位于人的11号染色体,包含几个功能域,其中ETS域对应DNA结合域,识别GGAA序列。PU.1主要表达于造血细胞,包括CD34+细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、肥大细胞和原始红细胞等。两种转录因子PU.1和CEBPa在造血干细胞形成、粒系及单核系的分化中起重要作用,它们相互之间的比例决定系的形成。造血细胞的发育起始于多能干细胞,在一系列谱系特异性转录因子的共同作用下分化为普通淋系祖细胞(CLPs)和普通髓系祖细胞(CMPs),进而终末分化。长期以来,人们认为细胞分化是一个不可逆转的过程,然而随着诱导性多能干细胞IPS (Induced pluripotent stem cell)技术的问世及其他学者将一种细胞类型转分化为另外一种细胞类型时,上述理论受到了极大的挑战。如过表达四个转录因子(Oct4,Sox2,Klf4和Myc)可以将成熟的体细胞诱导为多能干细胞IPS。学者Thomas Graf的一系列研究证实过表达转录因子CEBPa联合PU.1基因可将造血细胞相关的前体B/T细胞重编程为在形态和功能方面类似巨噬细胞样的细胞及本课题负责人冯茹教授将非造血细胞来源的成纤维细胞转分化为具有巨噬细胞功能样的细胞。那么转录因子表达水平的不同是否也可使白血病细胞的谱系发生改变呢?本课题的前期研究结果证实过表达CEBPa基因可将Burkitt淋巴瘤细胞株Raji的淋系相关的表型CD19等下调,与对照组相比过表达CEBPa基因的细胞增殖及迁移能力显著下降,但是并未出现巨噬细胞相关的表型Mac-1,于是我们想到将联合在巨噬细胞分化过程中起至关重要的转录因子PU.1基因,进一步探讨CEBPa和PU.1在急性淋巴细胞白血病转归方面的研究。为研究C/EBPa及PU.1对ALL白血病细胞的影响,我们应用慢病毒载体PWPXLD-PU.1+CEBPa-GFP以及对照组PWPXLd-GFP空载体、PWPXLD-PU.1-GFP、PWPXLD-CEBPa-GFP来转染Jurkat(急性T淋巴细胞白血病细胞株),建立稳定表达C/EBPa、PU.1、共表达载体CEBPa+PU.1以及空载体GFP的Jurkat细胞株,并进一步研究上述两个转录因子对白血病细胞株生物学行为的影响,旨在探讨转录因子C/EBPa、PU.1与ALL细胞转归之间的关系,为进一步了解白血病细胞类型转变提供依据,我们期望急性淋巴细胞白血病细胞株可以被高效率的转分化为巨噬细胞样的细胞或是降低其恶性程度,进而为白血病在治疗前后及复发时疾病类型发生转变提供理论基础以及为诱导分化治疗在急性白血病(非M3)中提供潜在的理论依据。材料和方法1.慢病毒载体的构建及无内毒素质粒的提取1)T-A克隆：在PubMed Gene数据库中查阅人源性CEBPa+PU.l基因CDS区(相对应的PubMed gene ID:1050和6688),根据酶切位点(PmeI和SpeI)设计引物,使用高保真DNA聚合酶扩增目的基因,纯化回收目的片段,将其与pEASY-T载体按照4：1的比例(总体积5u1)混匀,室温连接10-15minutes,转化、涂板,次日挑取单克隆菌落,置于37℃摇床10-12h扩增单克隆菌落,质粒小提、酶切鉴定单克隆菌落,并将酶切鉴定正确的质粒取2ug送Life公司测序,将测序结果与NCBI基因库中的序列比对,若为正确克隆,则用相应的酶进行酶切(SpeI和PmeI),然后琼脂糖电泳跑胶,紫外灯下切取目的条带,Magen凝胶回收试剂盒回收目的基因片段；2)表达载体的构建：双酶切(SpeI和PmeI)载体骨架,使之与目的基因露出相同的粘性末端,将上一步骤中回收的目的基因片段及载体骨架片段按照适当的比例混合,若为10ul体系则加入5ul Solution I,在16。C连接仪中放置1-2h,使其充分连接,之后按照前述方法进行转化、涂板,置37-C恒温培养箱中12-16h,次日挑取4个单克隆菌落,37。C摇床10-12h,质粒小提试剂盒抽提质粒,酶切鉴定。若鉴定为正确克隆,则与包装质粒、包膜质粒以一定比例混合在293T细胞中进行病毒试包装(具体步骤见后),24h后收集病毒上清,离心方式感染Jurkat细胞株,48h后FACS检测GFP的表达情况,若能成功感染目的细胞,分选出GFP阳性的细胞提取RNA,随后RT-PCR法验证是否有目的基因的存在,进而证实过表达载体构建成功。3)质粒提取：将上述步骤中能成功包装出病毒的表达载体及辅助质粒(PSPAX2和pMD2G)大量提取,按照Magen除内毒素试剂盒步骤进行。质粒洗脱过程中严格遵照无菌操作。2.病毒包装、滴度检测、感染目的细胞病毒包装前一天中板,以1x10*7细胞密度铺板15cm培养皿,次日待细胞融合度达80-90%左右即可进行病毒包装,包装前2h将培养基换为1%FBS+DMEM。将适当比例的表达载体及辅助质粒混合(具体用量见后protocal), Opti-MEM稀释质粒及转染试剂PEI,用脂质体阳离子转染法转染293T细胞,6-8h将293T培养基更换为1%FBS+DMEM,24h后倒置荧光显微镜下可见大量的绿色荧光,并分别于24h、48h和72h收集病毒上清,28000rpm*2h4。C高速离心浓缩病毒上清,超速离心完之后弃上清,加入100-200ul无血清或1640培养基重悬病毒,封口膜封口,置4℃冰箱过夜,次日分装病毒并进行病毒滴度检测,48h后FACS检测GFP表达情况,计算MOI,根据MOI加入适量的病毒上清感染目的细胞Jurkat,病毒感染目的细胞48h后FACS分选GFP阳性细胞并扩大培养,收集1x10*6细胞提取总RNA, RT-PCR法验证目的基因是否成功转入。3.观察C/EBPa及PU.1基因对Jurkat细胞的形态学的影响以病毒未感染的细胞Jurkat、转染GFP空载体的细胞和转染C/EBPa、PU.1及共表达PU.1+CEBPa基因的细胞株为研究对象,通过细胞形态学观察检测目的基因对Jurkat细胞株的增殖、分化等的影响。4.FACS每日检测CD3、Mac-1表达水平的变化流式检测病毒感染前后T淋巴细胞CD3和巨噬细胞表型Mac-1表达量的变化。通过特异性单克隆抗体标记CD3和mac-1两个表型,监测过表达转录因子后细胞表型的变化情况。5.FACS细胞标本的制备病毒感染目的细胞48h后,调整细胞浓度,取1x10*5细胞进行染色,300gx5minutes离心,弃上清,用50ul 1%FBS的PBS重悬细胞。每管标本中分别加入0.5ul相应的抗体,避光冰浴20-30minutes后加200ul 1%FBS的PBS洗去多余未结合的抗体,300g x5minutes离心,弃上清,200ul 1%FBS+PBS重悬细胞,上机检测。使用CD3和mac-1单克隆抗体标记CD3, Mac-1两个表型。6.相关基因的验证Trizal法提取RNA, TAKARA试剂盒合成cDNA的第一条链,-20度保存备用。RT-PCR验证相关基因的变化。7.数据分析FlowJo软件处理流式数据。Photoshop软件处理电泳胶图。结果1.T-A克隆T-A克隆的目的基因经双酶切琼脂糖凝胶电泳图证实与实际大小相符合(CEBPa 1077bp,电泳胶图实际大小接近1kb;PU.1816bp,电泳胶图实际大小近800bp)送Life公司质粒测序结果与NCBI数据库基因序列比对一致。2.包装病毒以PEI阳离子基因转染试剂将PWPXLD-GFP空载体、PWPXLD-CEBPa-GFP. PWPXLD-CEBPa+PU.1-GFP转染至293T细胞进行病毒包装(具体见protocal),24h后荧光镜下可见大量荧光,分别于转染后24h、48h和72h收集病毒上清,将三次收集的病毒上清超速离心浓缩病毒,测定病毒滴度,计算MOI (GFPNC:1.87x10*9 TU/ml; PU.1:3.0x10*9 TU/ml; CEBPa:1.3×10*9 TU/ml; CEBPa+PU.1:3.94×10*9 TU/ml;).根据MOI加入适当的病毒于Jurkat细胞中,48h后流式上机检测GFP阳性细胞分别为：Jurkat:GFP空载体：96.8%；PU.1:96%; CEBPa:81.6%; CEBPa+PU.1:75%3.细胞表面标记的变化FACS检测CD3和Mac-1表型：单独转染PU.1的细胞在48h后逐渐出现Mac-1的上调,高表达PU.1的Jurkat细胞在第8天约50%左右的细胞出现Mac-1阳性,而只有少部分细胞T系相关的表型CD3下调；单转染CEBPa的细胞出现大量的CD3下调而只有极少部分出现Mac-1上调,共转染PU.1+CEBPa的细胞T系相关的表型显著下调但并未出现mac-1。我们进一步分析mac-1阳性的细胞,结果显示其SSC和FSC值均较对照组增大。4.增值情况计数法及CCK-8实验检测细胞增殖情况：Jurkat转染空载体GFP和转染CEBPa、PU.1、CEBPa+PU.1的细胞分别在Oh、24h、48h和72h时进行两因素析因设计的方差分析,结果显示：随着时间的延长,除转染CEBPa组的细胞外其他组细胞增殖活性(OD值)逐渐增加(P<0.001)；Oh时6组细胞的OD值无显著差异(F=2.617, P=0.181),24h、48h和72h时6组细胞有显著差异(P<0.001),说明6组细胞的增殖活性不同,而转染C/EBPa的细胞与其他组细胞相比OD值显著降低(P<0.001),说明细胞增殖相对受抑。5.细胞形态学观察在普通倒置光学显微镜下观察6种细胞的生长状态,均为抱团、悬浮生长；经瑞氏-吉姆萨染色后,转染PU.1的细胞体积较其他组细胞大,胞浆中含有部分红色颗粒。6.相关基因的验证RT-PCR法验证相关基因表达的变化：通过半定量PCR法验证转染相关基因的细胞T系、巨噬细胞相关基因及转录因子表达水平的变化。结果显示与Jurkat细胞、转染空载体GFP的Jurkat细胞相比单转染PU.1组的Jurkat细胞株粒单核细胞相关的基因CD64, CD16, mac-1, GM-CSFR的mRNA转录水平明显升高,弱表达M-CSFR, G-CSFR。转录因子E2A、GATA-3和Notch-1均有不同程度的表达减弱。T淋巴细胞相关的基因Ragl, Rag2, lck等表达量无明显变化。单独转染CEBPa组的细胞,T淋巴细胞相关的基因lck显著减低,但是Rag1, Rag2稍有减低,并没有出现髓系相关的基因,转录因子表达水平也无变化。而共表达CEBPa+PU.1的细胞T系相关的基因lck和Ragl表达显著下调及弱表达髓系相关的基因CD64和mac-1,而淋系相关的转录因子E2A表达明显下调,T淋巴细胞相关的转录因子Ragl和Rag2稍有减弱。讨论：本课题旨在通过转基因技术将CEBPa、PU.l这两个转录因子导入在ALL细胞株中,期望能将ALL细胞诱导分化为具有巨噬细胞功能的细胞或是降低其恶性程度,增加化疗药物的敏感性,为诱导分化在ALL治疗中提供理论基础。前期研究结果证实过表达转录因子CEBPa能将ALL细胞株Raiji的B系相关的表型下调,形态学观察、细胞增殖实验、转录因子水平的变化均证实Raji细胞的恶性程度显著下降,但是并没有出现预期的细胞普系的转变,于是我们想到联合在巨噬细胞分化过程中具有重要作用的PU.1,我们希望在CEBPa和PU.1的共同作用下ALL细胞能够成功转分化为巨噬细胞功能样的细胞或是细胞的恶性程度显著降低。首先利用分子克隆技术,成功构建表达CEBPa、PU.1及共表达CEBPa+PU.1的慢病毒载体。以PEI阳离子基因转染法将上述基因成功转入Jurkat ALL细胞株中,结果显示单转染PU.1的细胞大部分细胞出现Mac-1阳性表型,单转染CEBPa的细胞CD3显著下调,同时细胞增殖受抑,有少量的Mac-1阳性的细胞出现,共表达两个基因(CEBPa+PU.1的细胞均出现不同程度的CD3下调,极少数细胞出现Mac-1上调。本课题研究证实转录因子CEBPa联合PU.1可以将ALL细胞Jurkat部分地转分化为Mac-1阳性的细胞。