【摘 要】
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近年来,H9N2亚型低致病性禽流感成为我国家禽中流行范围最广泛的亚型之一,感染家禽通常不发病,主要表现为生产性能降低,但当与H5、H7或其他病原体（如大肠杆菌、传染性支气管炎）混合感染时,会明显增加家禽的发病率和死亡率,严重阻碍了我国养禽业的健康发展。饲用益生菌具备绿色,安全,无污染等优点,现已成为畜禽养殖业理想的抗生素替代品。重组乳酸菌活疫苗因其可直接口服,给药方便,安全无毒等特点得到了广泛研究
【基金项目】
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国家水禽产业技术体系项目（CARS-42-19）； 山东省高等学校青创科技支持计划（2019KJF022）；
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近年来,H9N2亚型低致病性禽流感成为我国家禽中流行范围最广泛的亚型之一,感染家禽通常不发病,主要表现为生产性能降低,但当与H5、H7或其他病原体（如大肠杆菌、传染性支气管炎）混合感染时,会明显增加家禽的发病率和死亡率,严重阻碍了我国养禽业的健康发展。饲用益生菌具备绿色,安全,无污染等优点,现已成为畜禽养殖业理想的抗生素替代品。重组乳酸菌活疫苗因其可直接口服,给药方便,安全无毒等特点得到了广泛研究和应用。乳酸菌组成型表达系统不需要额外添加诱导剂就能够在菌体存活时表达外源基因,简化了操作过程且安全性相对较高,因此更适合应用到实际的工业生产中。本研究将H9N2 AIV主要保护性抗原HA2基因导入乳酸杆菌表达载体,构建了表面展示HA2蛋白的组成型重组乳酸杆菌。研究内容如下:1、益生乳酸杆菌的筛选本研究通过比较本实验室保存的干酪乳酸杆菌393、干酪乳酸杆菌0331、植物乳酸杆菌NC8、植物乳酸杆菌3356、植物乳酸杆菌3335和鼠李糖乳酸杆菌8945 6株乳酸杆菌体外耐酸（p H=2.5）、耐胆盐（0.125%和0.25%）、耐胃蛋白酶（3 mg/m L）、耐胰蛋白酶（1 mg/m L）性能以及抑菌性能（大肠杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌）,筛选出具有益生潜能的乳酸杆菌菌株。通过动物试验进一步评估了筛选的乳酸杆菌对黄鸡生长性能、消化机能、免疫性能、疫苗免疫滴度,血清抗氧化活力和盲肠菌群的影响。体外模拟试验和抑菌试验筛选出干酪乳酸杆菌0331、植物乳酸杆菌NC8、植物乳酸杆菌3356 3株具有益生潜能的乳酸杆菌。动物试验表明3株乳酸杆菌对黄鸡的生长性能、消化机能和免疫性能等均有不同程度的促进作用,但益生作用的强弱与所用菌种密切相关。植物乳酸杆菌NC8对提升黄鸡免疫机能的作用较好,对提高血清中Ig A、Ig G、IFN-γ含量和NDV抗体水平的作用优于对照组和其他处理组;植物乳酸杆菌3356对提高黄鸡生产性能和消化性能的作用较好,效果与金霉素相当;干酪乳酸杆菌0331的益生作用弱于金霉素和其他两株乳酸杆菌。2、表达H9N2禽流感病毒HA2蛋白重组乳酸杆菌的构建鉴于植物乳酸杆菌NC8对提升黄鸡免疫性能的作用较好,因此选择该菌作为构建重组乳酸杆菌的宿主菌。以增强型绿色荧光蛋白EGFP作为报告基因,将其与截短的锚定基因pgs A（聚-γ谷氨酸合成酶A）融合表达,比较了HCE、Slp A和p32 3种组成型启动子的启动活性,结果表明p32组成型启动子在NC8菌株中的启动活性较强,截短的pgs A′蛋白可以将EGFP锚定在菌体表面。对2019～2020年本实验室分离的来自山东、河南、江苏的9株H9N2 AIV HA基因进行了遗传进化分析,结果表明9株分离毒株均属于欧亚分支中的Y280-like分支;同源进化分析结果表明,分离毒株之间的HA基因同源性较近,核苷酸和氨基酸同源性均在92.8%以上;与疫苗株SS、F和6的HA基因同源关系稍远,核苷酸同源性均在89.7%以下,氨基酸同源性均在91.8%以下。本研究中9株H9N2 AIV HA蛋白的裂解位点均为RSSR↓GLF,符合典型低致病性禽流感病毒的特征,其中自山东省鸡体内分离的毒株SD与其他8株分离毒株的同源性均较近,核苷酸和氨基酸同源性达到94.5%以上,因此选用该毒株制备了抗HA2蛋白的多克隆抗体,间接ELISA试验结果表明多抗效价达到1:25600,Western Blot试验表明多抗能与重组蛋白发生特异性结合。最后将截短的锚定基因pgs A′与分离毒株SD的HA2基因融合构建了重组植物乳酸杆菌p32-pgs A′-HA2/NC8,Western Blot试验表明该重组乳酸杆菌成功表达pgs A′-HA2融合蛋白,IFA试验结果表明该重组乳酸杆菌可表面展示HA2蛋白。本研究首先通过体外模拟胃肠道环境试验、抑菌试验和动物试验筛选出植物乳酸杆菌NC8对黄鸡免疫性能的作用较好,因此选择将其作为构建重组乳酸杆菌的宿主菌。对2019～2020年本实验室分离的9株H9N2 AIV HA基因进行了遗传进化分析筛选出了与其他8株分离毒株同源关系均较近的H9N2病毒株SD,构建了表面展示HA2蛋白的组成型重组乳酸杆菌p32-pgs A′-HA2/NC8,为研制重组乳酸杆菌口服免疫制剂防治H9N2亚型禽流感提供了新选择。
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