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β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)由于具有多个结合位点,与其他配体的相互作用一直是研究热点之一。β-LG和儿茶素共存在食品体系里十分普遍。目前,蛋白质可以以非共价或者共价形式与多酚结合。已有大量学者研究了蛋白质与多酚的非共价作用,相互作用机理研究也较为透彻。共价结合近年来成为研究热点之一,共价作用是让蛋白质与多酚之间构成不可逆的共价键,所形成的共价物较非共价复合物更稳定。β-LG与多酚共价主要有碱法、自由基法,酶催化法等,碱法因操作简单,不必添加额外的催化物,广泛用于多酚和蛋白共价结合中。另外,儿茶素结构的差异势必会影响其与β-LG结合形成的复合物的结构和功能。然而,关于不同结构的儿茶素对其与β-LG形成的共价物结构和功能性质的影响及其形成机制尚不清晰。因此,本课题通过碱法(pH 9)制备四种儿茶素“表儿茶素(epicatechin,EC)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate,ECG)、表没食子儿茶素(epigallocatechin,EGC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate EGCG)”与β-LG的共价物,利用质谱和电泳等手段研究其机理,采用荧光、圆二光谱等技术比较其结构变化和差异性,通过间接性ELISA及抗氧化性测定比较其功能性质。主要得出了以下几点结论:1、结合机理实验结果:β-LG在碱性条件下(pH 9)可以与四种儿茶素(EC、ECG、EGC、EGCG)形成共价物,产生不同的颜色反应,颜色反应主要来自于儿茶素的自身氧化。与儿茶素共价结合后导致β-LG的分子量增加,1个β-LG分子可以共价交联1个EC或EGC分子、2个ECG或EGCG分子。共价结合导致β-LG的巯基和自由氨基含量减少,ECG和EGCG共价结合β-LG后导致巯基和自由氨基减少量高于EC和EGC。儿茶素结合当量实验表明β-LG结合儿茶素最高的是ECG,其次是EGCG,结合量最低的为EC。儿茶素与β-LG在碱性条件下的结合形成机理推测为:儿茶素在pH 9溶液中,会主动氧化成醌,儿茶素结构不同导致氧化成醌的时间不同,EC和EGC氧化成醌较慢,再氧化成醌的时候便与β-LG共价结合,EC和EGC继续氧化成二聚体时,β-LG结合位点饱和,不再结合EC和EGC的二聚体;ECG和EGCG自动氧化成醌的时间短,立即继续氧化成二聚体,再与β-LG共价结合。2、结构表征实验结果:共价结合后导致荧光猝灭,并伴随着最大荧光强度红移,β-LG-ECG、β-LG-EGCG的猝灭强度远大于β-LG-EC、β-LG-EGC。傅里叶红外变换光谱表明儿茶素共价结合β-LG后导致β-LG酰胺A带以及酰胺Ⅰ带的特征峰发生偏移,峰形变宽。圆二实验表明四种共价物的二级结构发生不同程度的改变,主要体现在β-sheet的降低以及β-turn和unordered的增加,三级结构也发生不同程度的改变,ECG和EGCG共价结合β-LG导致三级结构改变程度高于EC和EGC。不同的儿茶素与β-LG蛋白共价结合还会导致β-LG的疏水环境改变,具体表现为疏水性降低,亲水性增加,其中β-LG-ECG、β-LG-EGCG的表面疏水性低于β-LG-EC、β-LG-EGC。3、功能表征实验结果:β-LG与四种儿茶素在碱性条件下(pH 9)共价结合后,抗氧化性能得到明显提升,DPPH、ABTS、FRAP实验表明共价物β-LG-ECG和β-LG-EGCG的抗氧化性能优于β-LG-EC和β-LG-EGC。但同时,β-LG与四种儿茶素共价结合后,抗原反应性增加,导致增加潜在的致敏性风险,其中共价物β-LG-ECG和β-LG-EGCG的抗原反应性高于β-LG-EC和β-LG-EGC。这些变化与其共价结合过程中的结合方式和构象改变有关。