1研究目的本论文在前期实验研究的基础上,采用高通量的方式,利用转录组技术分析无机磷酸盐对小鼠整体基因表达水平的影响,通过寻找与对照组相比显著差异表达的基因,确定研究方向,并做进一步的机制探讨。试验根据转录组分析结果,通过实时定量PCR技术进一步确证了无机磷可造成趋化因子CXCL11基因表达的改变,进而聚焦于分泌CXCL11的T淋巴细胞及其亚群分化与无机磷摄取水平的相关性分析,从新的角度探讨高无机磷摄取水平对机体免疫系统的影响。2研究方法(1)动物实验。对SPF级BALB/c雌性小鼠进行连续15天灌胃无机磷酸盐食品添加剂受试物,并使用LPS静脉注射刺激小鼠免疫系统,观察无机磷酸盐的摄入对LPS诱导的小鼠炎症反应的影响。(2)流式细胞术实验。进行胸腺摘取,提取相关T淋巴细胞后,使用流式细胞仪去检测小鼠体内T淋巴细胞亚群的百分率,检测的这些因子分别是CD3~+、CD4~+、CD8~+、CD25~-、CD25~+、CD28~+、CD28~-细胞,以及Ts/Tc的比值,初步分析无机磷酸盐对T细胞亚群分化的影响。(3)转录组分析。运用转录组高通量检测手段研究高无机磷膳食对实验小鼠免疫系统、肿瘤进展相关基因表达的影响。初步挖掘出高无机磷膳食调控小鼠免疫功能的显著性通路,并筛选出差异基因。(4)q-RTPCR验证。从RNA-Seq实验中我们筛选出了差异基因后,需要对这些差异基因进行进一步的验证,分析我们挖掘出的差异基因在免疫显著性通路中的作用和调控机制,从而验证高无机磷膳食是否对小鼠的免疫系统具有干扰作用并对其进行分析。3研究结果(1)动物实验表明,在15天的灌胃过程中,空白对照组、LPS模型组以及不同浓度的无机磷酸盐剂量组的小鼠生理活动和状态无明显差异。当进行LPS注射后,LPS模型组以及磷酸盐剂量组小鼠出现精神不振,摄食量明显下降的现象。表明炎症模型建立成功,接下来通过解剖实验进一步分析。(2)流式细胞术实验表明:当使用100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg的无机磷酸盐食品添加剂灌胃时,与LPS模型组相比,随着无机磷酸盐食品添加剂浓度的不断上升,CD4~+T、CD3~+T淋巴细胞的数量逐渐下降。而不同剂量浓度的无机磷酸盐,对CD25~+、CD25~-、CD28~+、CD28~-等T淋巴细胞亚群及Ts/Tc的比例有不同的影响,需要综合分析。(3)转录组分析结果:GO数据显示,无机磷酸盐在一定程度影响着小鼠脾脏的相关功能,如免疫应答、与炎症相关的趋化因子。在KEGG Pathway部分,我们选取了两条免疫显著性通路Toll-like Receptors pathway、HIF-1 signaling pathway进行进一步分析。通过与LPS组对照分析,筛选出3个显著差异基因STAT1、STAT3和CXCL11。与LPS模型组相比,STAT1和CXCL11表达下调,,STAT3表达无显著性变化。(4)实时荧光定量PCR实验验证表明:差异基因STAT1、CXCL11的验证结果与转录组测序得到的结果相一致,为深入研究无机磷酸盐食品添加剂对小鼠免疫系统和肿瘤发生的影响提供了依据。4研究结论本研究采用流式细胞术检测与免疫相关的胸腺器官中T淋巴细胞亚群,验证了小鼠的T细胞亚群的平衡受到破坏,机体的免疫系统水平在下降。同时,高通量测序检测脾脏这一免疫器官的转录组数据,进一步丰富了样本的数据库资源,验证了无机磷酸盐食品添加剂对BALB/c小鼠具有免疫抑制作用,以及初步筛选出与免疫相关的显著性通路。为进一步深入研究无机磷酸盐对免疫机制影响的机理打下基础。