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铜绿假单胞菌是机会致病性细菌,近年来由于抗菌药物的广泛使用,其耐药现象已经成为国内及全球性问题,给临床感染治疗带来巨大挑战。碳青霉烯类是目前被认为最有效的治疗多重耐药革兰阴性菌的抗菌药物之一。但是随着它的广泛应用及不合理使用,铜绿假单胞菌对碳青霉烯类的耐药率也在不断增加,这将使得临床面临无药可用的困境。为了给临床合理使用碳青霉烯类抗菌药物及制定科学的耐药预防策略提供参考,本研究采用分子分型方法对国内碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌进行流行病学遗传背景分析,并进一步地探讨其耐药机制。本研究于2010年1月至2010年12月之间收集了来自全国22个省市,65家医院的2818株铜绿假单胞菌,采用纸片扩散法对其进行常规的16种抗菌药物体外药敏试验。根据药敏结果选择碳青霉烯类或头孢他啶不敏感的896株铜绿假单胞菌进行多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing, MLST)分析,采用DNA拼接软件和网站鉴定等位基因型(Allele Type)和序列型(Sequence Type, ST),借助BioNumerics软件对其进行遗传和多样性分析。体外药敏试验结果提示亚胺培南(Imipenem, IPM)、美罗培南(Meropenem, MEM)和头孢他啶(Ceftazidime, CAZ)的耐药率分别为23.1%、18.1%和15.3%,而其他主要β内酰胺类抗菌药物的耐药率在15-25%左右。MLST结果提示896株铜绿假单胞菌中,632株细菌属于116种ST型,201株属于104种新的已知基因组合,63株含某个或几个新管家基因型并组成了新的34种ST型。主要的ST型有ST244、ST277、ST235和ST274等。ST型种类与菌株数量间存在明显的线性相关,提示ST型种类较多且分散。从BioNumerics软件生成的最小生成树分析亦提示这些菌株的克隆型别较多,遗传背景多样。对627株碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌进行碳青霉烯类耐药机制研究。对所有菌株进行PCR筛查常见β内酰胺酶基因,对筛查到的金属酶基因阳性的菌株进行脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)同源性分析,并利用S1核酸酶-PFGE和Southern blot杂交进行基因定位分析。选择四种不同表型的菌株,即137株IPM-R、MEM-I/S的,40株IPM-I/S、MEM-R的,118株IPM-R、MEM-R的,和75株IPM-S、MEM-S的菌株,采用PCR方法扩增oprD基因全长查看突变型别。另外,挑选9株IPM-R、MEM-I/S的,9株IPM-I/S. MEM-R,9株IPM-R、MEM-R的,和8株IPM-S、MEM-S的菌株,采用实时荧光定量PCR (Quantitive Real-Time PCR, qPCR)方法检测四种常见RND家族外排泵基因的相对表达量,即MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN和MexXY。最后采用突变体库方法探索碳青霉烯类的新耐药机制。β内酰胺酶基因筛查结果提示627株碳青霉烯不敏感菌株中仅29株菌株碳青霉烯酶阳性,主要是IMP-1、IMP-25和VIM-2、S1-PFGE和Southern blot杂交将其定位于质粒上。亚胺培南和美罗培南耐药菌株中oprD基因均存在不同程度的突变型别,主要突变类型为氨基酸改变型。35株四种不同耐药表型菌株的外排泵基因表达结果提示仅2.8%菌株的外排泵高表达。因此,中国碳青霉烯类不敏感铜绿假单胞菌整体呈现克隆多样性分布遗传背景,未出现明显的克隆流行。碳青霉烯类的主要耐药原因为oprD基因突变,碳青霉烯酶阳性和外排泵高表达不是主要原因。