论文部分内容阅读
目的:应用Micro-PET扫描技术等方法观察丹酚酸B抗心肌缺血作用,同时比较丹酚酸B不同给药途径及其与丹参类制剂的抗心肌缺血作用差异;并从溶酶体酶环节探讨丹酚酸B抗心肌缺血作用的可能机制,为丹参类制剂的临床合理应用及丹参中主要有效成分丹酚酸B的开发应用提供实验依据。方法:1、SD大鼠24只,雌雄各半,随机分为4组:空白组、模型组、丹酚酸B低、高剂量(3.2、6.4mg/kg)组。除空白组外各组大鼠应用冠状动脉左前降支结扎法制备心肌缺血模型。分别在建模后第一天和给药第7天尾静脉注射显像剂18F-FDG和13N-NH3,注射lh后,进行Micro-PET扫描,通过扫描图像分析观察丹酚酸B对大鼠心脏平均标准摄取值(Standard Uptake Value,SUV),通过感兴趣体积(Volume of Interest,VOI)勾画,评价大鼠心肌梗死率的变化。2、48只犬随机分为8组,假手术组、模型组、丹参注射液组(2g生药/kg)、注射用多酚酸盐组(6.67mg/kg)、丹酚酸B 口服组(20mg/kg)、丹酚酸B低、中、高(1.6、3.2、6.4mg/kg)剂量组。动物麻醉后,行结扎冠脉结札制备心肌制备模型。记录结扎前、结扎15min和给药后 1、5、10、15、30、45、60、90、120min 的 ECG、SAP、DAP、MAP、HR。统计各标测点EECG的ST段偏移∑-ST以及ST段抬高≥2mv以上的N-ST。各组分别于给药前和给药60min后,左心室取血测动脉血氧,冠状窦处取血测冠状窦血氧,以两者氧压差评价心肌耗氧;于结扎前、结扎15min、给药60min后股静脉取血,用试剂盒测定血清CK、LDH值。实验结束后,称取全心重和心室重量,并进行NBT染色,应用称重法计算心脏梗塞范围和百分率。3、H9C2细胞计数后以104个/孔接种于96孔板中培养,以200μmol/LH202诱导H9C2,制备氧化损伤细胞模型,MTT法观察丹酚酸B不同剂量对H202诱导后H9C2细胞增殖的影响,利用氧敏感荧光探针DCFH-DA及流式细胞仪检测细胞内ROS的表达水平,试剂盒培养上清中CK、MDA及CTSD含量的变化。4、60只SD大鼠随机分别为空白组,模型组,阳性组(丹参注射液4000mg/kg),丹酚酸B低、中、高剂量(3.2、6.4、12.8mg/kg)组。各组以2ml/kg体积尾静脉注射对应药物,连续给药7天。第5天给药后除空白组外,尾静脉注射ISO 5mg/kg,每日2次,连续2天。ISO造模后第3天,大鼠禁食不禁水12h,于给药后30min,描记心电图(ECG),观察ST段水平的变化。心电图记录完毕后,取血测定血清肌酸磷酸激酶,β-葡萄糖醛酸酶和组织蛋白酶D的活性。取部分心脏制成10%匀浆,测定心脏匀浆中β-葡萄糖醛酸酶和组织蛋白酶D的含量。另取部分心肌组织匀浆高速离心制备分离出溶酶体匀浆,测定心脏溶酶体匀浆中β-葡萄糖醛酸酶和组织蛋白酶D的含量。取心脏中下1/3处的部分心肌观察心肌梗死面积。结果:1、与模型组比较,丹酚酸B能明显增加缺血后心肌18F-FDG、13NH3·H2O摄取值(P<0.05,P<0.01),明显降低心肌梗死率(P<0.01)。提示丹酚酸B增加心肌缺血组织的血流灌注,改善心脏能量代谢,具有良好的抗心肌缺血作用。2、与模型组比较,丹酚酸B注射给药低、中、高三个剂量组均能显著减少心肌耗氧量(P<0.05),降低冠脉结扎所致心肌梗塞麻醉犬的∑-ST、N-ST,部分时间点与模型组比较差异显著(P<0.05,P<0.01)。此外三个剂量组均可显著减少麻醉犬冠脉结扎所致心肌梗塞后LDH和CK的释放,减少麻醉犬冠脉结扎所致心肌梗塞范围(P<0.05,P<0.01)。相对于口服组对SAP、DAP、MAP的降低作用,丹酚酸B注射低剂量组能够相对升高SAP、DAP、MAP,中剂量组可升高SAP、MAP,高剂量组能升高MAP,与口服组比较差异显著(P<0.05,0.01);中、高剂量组减慢心率以及降低心肌耗氧量的作用也强于口服组(P<0.05);中、高剂量组部分时间点降低∑-ST和N-ST的效果也优于口服组(P<0.05,P<0.01)。此外丹酚酸B低、中、高三个剂量组降低LDH、CK的释放和减少心肌梗塞范围的作用也强于口服组(P<0.05,0.01)。与注射用多酚酸盐组比较,丹酚酸B高剂量组于药后多个时间点对∑-ST和N-ST的降低作用更强,对麻醉犬冠脉结扎所致心肌梗塞范围的减少作用也更强(P<0.05,P<0.01)。3、与正常组比较,H2O2组细胞H9C2增殖率显著下降(P<0.01)。与H2O2组比较,丹酚酸B浓度在0.1,1,10μmol/几时,能明显提高H2O2损伤后H9C2细胞的增殖率(P<0.01)。与H2O2组比较,丹酚酸B浓度在0.1,1,10μmol/L时,能显著降低受损H9C2细胞内ROS荧光强度水平(P<0.05或P<0.01)降低细胞上清中CK、MDA及CTSD含量水平(P<0.05或 P<0.01)。4、与模型组比较,在5-30min时间段,丹酚酸B中、高剂量组对T波的抬高值均明显降低(P<0.05或P<0.01);在lOmin、20min处,丹酚酸B低剂量组T波抬高值明显降低(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,丹酚酸B高、中、低剂量组血清中肌酸磷酸激酶(CK)活力、血清中β-葡萄糖醛酸酶活力均明显降低(P<0.05或P<0.01);丹酚酸B高剂量组血清中组织蛋白酶D显著下降(P<0.05或P<0.01);丹酚酸B高、中剂量组心肌组织匀浆中组织蛋白酶D均明显降低(P<0.05或P<0.01);丹酚酸B三个剂量组心脏溶酶体匀浆中β-葡萄糖醛酸酶活力均显著升高(P<0.05或P<0.01);同时丹酚酸B高剂量心脏溶酶体匀浆中组织蛋白D含量显著提高(P<0.05或P<0.01)。病理组织学观察显示,丹酚酸B高、中剂量组能明显改善缺血心肌组织的病理学变化,其中,与模型组比较,心肌纤维变性坏死、炎细胞浸润的改善程度具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:1、应用Micro-PET分子影像技术观察显示,在活体条件下丹酚酸B对大鼠心肌缺血具有明显改善作用。2、丹酚酸注射给药能明显减轻犬冠脉结扎后的心肌缺血程度,且丹酚酸B注射给药对心肌缺血的改善时间和程度均优于口服给药。3、丹酚酸B能明显对抗H2O2所致的H9C2细胞损伤,其作用与抑制过氧化损伤、抑制损伤细胞中溶酶体内组织蛋白酶释放,保护心肌细胞有关。4、丹酚酸B能改善大鼠心肌缺血发生时的心电图变化及其组织病理学改变,其作用机制可能是丹酚酸B抑制缺血后心肌组织中组织蛋白酶的释放,保护缺血心肌,改善心肌缺血状况。