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深海环境中分布着种类繁多、数量巨大的微生物,直接或间接参与了全球海洋生物地球化学循环。这些微生物具有复杂的生理生化特性和分子生物学机制,以适应深海低温(局部高温)、高压、高盐、黑暗、寡营养等极端环境。因此,研究深海极端环境中微生物,为探究地球化学循环规律,揭示极端环境生命适应机制,以及生命的进化过程提供理论参考。雅浦海沟位于雅浦海脊和雅浦群岛东侧,南北长650 km,最深可达8527 m,北接世界最深的海沟—马里亚纳海沟,是典型的超深渊环境。雅浦海沟极端环境特征制约着碳、氮、硫等生源要素分布和生物群落组成,形成超深渊环境独特的物质循环和能量流动体系。2017年6月13日,我国载人深潜器“蛟龙号”在执行38航次152潜次雅浦海沟科学考察中,获得了沉积物样品和海参、海星、钩虾等底栖生物样本。本研究采用传统培养方法、高通量测序技术(16S r DNA的V3-V4可变区基因测序、宏基因组测序),以雅浦海沟和马里亚纳海沟沉积物,雅浦海沟海参、海星和钩虾的肠道内容物为研究对象,研究可培养微生物多样性,以及雅浦海沟海参肠道环境中微生物及其碳、氮、硫等代谢途径关键酶基因的多样性,并分析这些基因的系统进化地位。研究为揭示深海环境地球化学循环特点及生命的进化过程提供理论参考。1、以雅浦海沟和马里亚纳海沟共11个站位的沉积物为研究对象,共分离培养获得了586株细菌,主要包括:变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)。其中,变形菌门(Proteobacteria)菌株数量最多,主要包括α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)和γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)。分离获得真菌86株,主要属于子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)。从雅浦海沟海参、海星和钩虾肠道中,共分离、培养获得了110株细菌,分别属于变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria),其中,变形菌门(Proteobacteria)中的γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)和α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)占据绝对优势。2、利用Miseq高通量测序技术,测定了雅浦海沟海参肠道微生物16S r DNA的V3-V4可变区基因序列,并与近海养殖刺参(Apostichopus japonicus)肠道微生物的多样性和组成进行比较。结果表明,雅浦海沟海参的肠道细菌的多样性(辛普森指数和Chao1指数)和丰富度(ACE指数和香农指数)均低于养殖刺参的。雅浦海沟海参肠道细菌主要包括:γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria,34.1%),α-变形菌纲(Alphaproteobacteria,16.0%)和拟杆菌门(Bacteroidetes,24.0%);古菌主要由奇古菌门(Thaumarchaeota,98.8%)组成。化能自养的氨氧化古菌亚硝化侏儒菌属(Nitrosopumilus)相对丰度达95.6%,甲基营养的硝酸盐还原菌Methylotenera相对丰度为10.6%;养殖海参肠道细菌中,硫酸盐还原菌(28.1%)和硫氧化细菌硫卵形菌属(Sulfurovum,13.7%)相对丰度较高。这种组成差异可能反映了超深渊和近海沉积环境中氮循环和硫循环不同特征。3、利用宏基因组测序技术对雅浦海沟海参和养殖海参肠道微生物组成及其代谢与生理功能进行了整体分析。雅浦海沟海参肠道微生物主要为变形菌门(Proteobacteria,64.3%),以γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria,39.6%)为主,其次为拟杆菌门(Bacteroidetes,17.7%)和奇古菌门(Thaumarchaeota,9.1%)。雅浦海沟海参肠道微生物KEGG和COG的比对结果表明,与代谢相关的基因(氨基酸代谢、碳水化合物代谢、能量代谢等)占绝对优势,与信号转导、信息处理相关的基因所占比例也较高。CAZy比对结果表明,雅浦海沟海参肠道微生物中,糖苷转移酶类相对丰度最高,其次为糖苷水解酶类、糖水化合物脂酶类等。这说明,超深渊环境中,微生物转运和利用胞外氨基酸、糖类等有机物进行异养代谢的能力,是微生物生存所必需的。同时,海参肠道微生物信号转导、信息处理的功能基因较丰富,可能是肠道微生物反映了深海极端环境(低温、高压及高盐度等)胁迫下的适应机制。4、在雅浦海参肠道微生物宏基因组中发现了与氮代谢相关的功能基因,如参与尿素降解产铵、氨氧化、反硝化和硝化途径的基因,包括ure C/D/H(编码脲酶C/D/H亚基基因)、nir B/K/D(编码亚硝酸还原酶B/K/D亚基基因)、nor Q(编码一氧化氮还原酶Q亚基基因)、amo A/B/C(编码氨单加氧酶A/B/C亚基基因)等。这些基因编码的蛋白序列与奇古菌门(Thaumarchaeota)的海洋亚硝化侏儒菌属(Nitrosopumilus)的亲缘关系最近。这表明亚硝化侏儒菌(Nitrosopumilus)在雅浦海沟产铵、氨氧化、硝化作用和反硝化作用中具有重要作用。雅浦海参肠道中的亚硝化侏儒菌(Nitrosopumilus)、亚硝化螺菌属(Nitrosospira)和亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)中含有产甲烷的I型甲基辅酶M还原酶基因mcr A和调控甲烷氧化过程的颗粒性甲烷单加氧酶基因pmo A。与此相反,在养殖海参肠道中含有丰富与硫循环相关的功能基因,主要包括sqr(编码硫化物:醌还原酶基因)、apr A/B/E/X(编码腺苷酰硫酸还原酶A/B/E/X亚基基因)、sat(编码硫酸腺苷酸转移酶基因)、sox A/B/X/Y/Z(编码吗硫代硫酸盐氧化酶系基因)和dsr(编码亚硫酸盐还原酶基因)。这些基因编码的蛋白序列与海球菌属(Halioglobus)和Desulfobulbaceae科脱硫叶菌属(Desulfobulbus)的亲缘关系最近。海球菌属(Halioglobus)和脱硫叶菌属(Desulfobulbus)参与的硫氧化和硫酸盐还原过程,是近海养殖区域硫循环的重要组成部分。