论文部分内容阅读
1目的:探讨胰腺癌组织中信号传导和转录激活因子3 (signal transduction and activators of transcription-3, STAT3)和转移相关基因的表达情况及其与胰腺癌临床病理特征的关系;应用Janus激酶(Janus kinase, JAK)抑制剂AG490和STAT3特异性小干扰RNA表达载体阻断STAT3信号通路,探讨阻断STAT3信号通路对胰腺癌细胞侵袭转移能力的抑制作用及其可能机制。方法:⑴免疫组织化学方法检测34例胰腺癌和10例正常胰腺组织中STAT3、磷酸化STAT3 (phosphorylated STAT3, p-STAT3)、基质金属蛋白酶-2 (matrix metalloproteinase-2, MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)的表达。⑵细胞侵袭测定试剂盒检测人胰腺癌细胞株SW1990和CaPan-2的体外侵袭力;Western blot检测SW1990和CaPan-2细胞中STAT3、p-STAT3蛋白的表达;电泳迁移率实验(electrophoresis mobility shift assay, EMSA)检测SW1990和CaPan-2细胞中STAT3的DNA结合活性。应用AG490处理SW1990和CanPan-2细胞,细胞侵袭测定试剂盒检测细胞体外侵袭力的改变,Western blot检测STAT3、p-STAT3蛋白表达的变化,EMSA检测STAT3的DNA结合活性的变化, Western blot和RT-PCR分别检测转移相关基因蛋白和mRNA表达的变化。⑶构建三条STAT3特异性小干扰RNA(small interfere RNA, siRNA)表达载体,并瞬时转染SW1990细胞,RT-PCR和Western blot观察STAT3 siRNA表达载体对SW1990细胞中STAT3的抑制作用。选择最为有效的STAT3 siRNA表达载体稳定转染SW1990细胞,细胞侵袭测定试剂盒和裸鼠体内急性血路转移模型观察SW1990细胞STAT3沉默前后侵袭转移能力的改变。RT-PCR和Western blot分别检测SW1990细胞STAT3沉默前后转移相关基因mRNA和蛋白表达的改变。结果:⑴免疫组化发现p-STAT3、MMP-2和MMP-9在胰腺癌组织中存在高表达,p-STAT3、MMP-2和MMP-9表达均与临床分期及淋巴结转移有关(P<0.05)。p-STAT3与MMP-2的表达呈正相关(r=0.583, P=0.000),p-STAT3与MMP-9的表达亦呈正相关(r=0.410, P=0.016)。⑵体外侵袭实验发现SW1990细胞比CaPan-2细胞具有更高的侵袭力。高侵袭力细胞株SW1990中存在p-STAT3蛋白的高表达,而低侵袭力细胞株CaPan-2中呈低表达;EMSA实验亦证实SW1990细胞的STAT3的DNA结合活性明显比CaPan-2细胞高。用AG490处理48h后,对CanPan-2细胞的侵袭力无明显影响,但可明显抑制SW1990细胞的侵袭力,且随AG490浓度升高,SW1990细胞的侵袭力抑制愈强。AG490可明显抑制SW1990细胞中p-STAT3蛋白表达和STAT3的DNA结合活性。AG490处理SW1990细胞48h后,MMP-2和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的蛋白和mRNA表达均明显下调,且其表达随着AG490浓度增大而有逐渐降低的趋势。⑶成功构建三条STAT3 siRNA表达载体( pRNAT-STAT3 siRNA-I ,pRNAT-STAT3 siRNA-II , pRNAT-STAT3 siRNA-Ⅲ)和阴性对照表达载体pRNAT-Con。三条STAT3 siRNA表达载体瞬时转染SW1990细胞后,STAT3的mRNA以及蛋白的表达量与未转染组相比均明显下降(P<0.05),其中pRNAT-STAT3 siRNA-II组中mRNA和蛋白的表达水平分别比未转染组下降了78.5%和71.8%。选择STAT3 siRNA表达载体pRNAT-STAT3 siRNA-II稳定转染SW1990细胞,G-418持续筛选,建立稳定表达STAT3 siRNA的长期基因沉默的细胞SW1990-RNAi-a和SW1990-RNAi-b。体外侵袭实验和体内转移实验表明SW1990-RNAi-a和SW1990-RNAi-b细胞的侵袭转移能力较SW1990亲代细胞明显下降。RT-PCR和Western blot显示SW1990-RNAi-a和SW1990-RNAi-b细胞中MMP-2和VEGF的mRNA和蛋白表达较SW1990亲代细胞均明显下调。结论:⑴p-STAT3、MMP-2和MMP-9在胰腺癌组织中存在高表达,且与临床分期和淋巴结转移有关;p-STAT3与MMP-2和MMP-9的表达呈正相关。STAT3可能通过上调MMP-2和MMP-9的表达促进胰腺癌侵袭转移,在胰腺癌发生发展中起着重要作用。⑵STAT3活性与胰腺癌细胞的侵袭力密切相关;AG490阻断STAT3活化可通过下调MMP-2和VEGF表达,抑制胰腺癌细胞体外侵袭能力。阻断STAT3信号通路可能为预防和治疗胰腺癌的侵袭转移提供一种新的策略。⑶成功构建STAT3 siRNA表达载体,并且有效抑制STAT3表达;稳定转染STAT3 siRNA表达载体能高效、特异的抑制STAT3表达,通过下调MMP-2和VEGF表达,显著抑制人胰腺癌细胞侵袭转移能力。RNAi沉默STAT3的治疗策略可能为防治胰腺癌的侵袭转移提供新的思路。