目前,氟苯尼考（Florfenicol,FF）广泛用于治疗山羊传染性胸膜肺炎和大肠杆菌病等疾病。FF与多西环素（Doxycycline,DOX）是兽医临床中常见的药物组合,两者联用可产生协同作用。但当两种药物联用时,不仅要考虑疗效,还要考虑它们之间可能产生的相互作用。药物间相互作用以代谢性相互作用为主,代谢加快会导致药效降低;代谢减慢会导致药物蓄积,从而增大药物毒性或加重残留问题。此外,据我国农业部历年监测表明,我国生鲜食品中单一污染物残留超标现象有所减少,而多种低残留污染物共存现象显著增加。因此,从代谢的角度研究FF与DOX间的相互作用很有必要。本课题借助肝微粒体和重组CYP450代谢酶两大系统以研究FF与DOX联用在山羊体外模型中的代谢规律,通过在山羊体内开展残留消除试验以研究二者联用在山羊体内的残留消除规律,并提出二者联用时合理的休药期标准。研究内容和研究结果如下:1山羊肝微粒体中多西环素对氟苯尼考代谢的影响为研究DOX对FF在山羊肝微粒体中代谢的影响,本试验分为两组:单一组中仅以FF与肝微粒体共孵育;联合组中以FF和DOX与肝微粒体共孵育,通过对比两个组合中FF的关键代谢物氟苯尼考胺（Florfenicol amine,FFA）的生成量,判断DOX对FF代谢的影响。结果表明,与单一组相比,联合组中DOX的加入会使FFA的生成量显著性减少,表明DOX抑制了FF的代谢。为进一步探究FF代谢与CYP450酶间的关系,试验选取六种代谢酶CYP2D6、CYP2E1、CYP2A6、CYP1A、CYP2C9和CYP3A的抑制剂奎尼丁、4-甲基吡唑、甲氧沙林、香叶木素、磺胺苯吡唑和酮康唑分别与FF在肝微粒体中共孵育,通过对FFA生成量的测定,筛选代谢FF最关键的代谢酶。结果表明,对FFA生成量影响最显著的代谢酶为CYP3A,即山羊肝微粒体中代谢FF的最关键代谢酶为CYP3A。2 CYP3A24与多西环素和氟苯尼考代谢之间的关系为进一步研究CYP3A在FF和DOX代谢中的作用。本试验通过核苷酸和氨基酸序列的比对,确定山羊中与人CYP3A4基因同源性最高的为CYP3A24基因。而后以人的CYP3A4为模板进行同源模建,得到了山羊CYP3A24的蛋白模型。将CYP3A24分别与FF和DOX进行分子对接,结果表明,影响FF代谢的关键氨基酸可能为R105、R372和R440,影响DOX代谢的关键氨基酸可能为T309和R440。通过原核载体构建,得到p ET-28a（+）-CYP3A24质粒。通过定点突变,将分子对接得出的氨基酸进行突变,通过蛋白纯化,得到CYP3A24及其突变体蛋白。而后将CYP3A24蛋白、各突变蛋白分别与FF孵育,通过测定氨基酸突变前后FFA生成量的变化,确定CYP3A24中影响FF代谢的最关键氨基酸位点。结果表明,当氨基酸R105突变为A105后,FF代谢加快,而当R372突变为A372、R440突变为A440时,均导致FF代谢减慢,其中R440对代谢的影响极为显著,即R440可能为影响FF代谢的最关键氨基酸。为研究DOX对FF代谢的影响与CYP3A24间的关系,将FF单一组、FF与DOX联合组两个组合分别与CYP3A24蛋白孵育,结果表明,当FF与CYP3A24蛋白共孵育时,DOX的加入会抑制FF的代谢。即DOX对FF代谢的影响与CYP3A24的作用密切相关。由于R440是DOX和FF与CYP3A24分子对接的共同位点,R440又是影响FF代谢的最关键氨基酸,因此本试验推测当DOX与FF联合使用时,DOX可能会竞争CYP3A24中代谢FF的R440,从而影响FF代谢。3山羊可食性组织中氟苯尼考、氟苯尼考胺和盐酸多西环素检测方法的建立组织中提取FF与FFA的试剂为2%氨化乙酸乙酯,超声提取两次后上清液经氮气吹干,以5%乙酸复溶,净化方式为MCX固相萃取、正己烷去脂后过0.22μm滤膜;盐酸多西环素（Doxycycline hyclate,DOX-HCL）的提取剂为Na2EDTA-Mac Ilvaine缓冲液,振荡提取两次后以氮气吹干,沉淀物以甲醇溶解。净化方式为HLB固相萃取、正己烷去脂后过0.22μm滤膜。检测方法为高效液相色谱-串联质谱法。流动相为0.1%甲酸水-乙腈,梯度洗脱如下:0-1 min,10%乙腈;1-5 min,10%-70%乙腈;5-6 min,70%乙腈;6-6.1 min,70%-10%乙腈;6.1-9.0 min,10%乙腈。电喷雾正负离子模式电离。该方法下FF、FFA和DOX-HCL的浓度与它们的峰面积间相关系数均大于0.99,方法的检测限为5μg/kg,定量限为10μg/kg,在LOQ、1/2 MRL和MRL 3个添加浓度下,FF、FFA和DOX-HCL在肝脏、肾脏和肌肉中回收率在70.62%～113.55%之间,批内变异系数小于11.08%,批间变异系数小于9.93%。该方法满足兽药指残留导原则（征求意见稿）中对残留分析方法的要求。4氟苯尼考单一组、氟苯尼考与盐酸多西环素联合组在山羊体内的残留消除研究健康波尔山羊杂交后代54头,体重32.0±4.0 kg。适应饲养7天后。随机分为三组:FF单一组（24头）,FF与DOX联合组（24头）,对照组（6头）。单一组给药方案为:FF（20 mg/kg b.w.）,颈部肌肉注射,每48 h给药1次,共给药2次。联合组给药方案为:FF（20 mg/kg b.w.）,颈部肌肉注射,每48 h给药1次,共给药2次;DOX-HCL（10 mg/kg b.w.）,颈部肌肉注射,每24 h给药1次,给药3 d。于停药后0.5 d、1 d、3 d、7 d、14 d和21 d宰杀动物,每个时间点宰杀9头,其中空白组1头,单一组和联合组各4头。采集肝脏、肾脏、肌肉和注射部位肌肉,经样品前处理后上机检测。结果如下:肾脏为DOX-HCL的残留靶组织,肝脏为FF和FFA的残留靶组织。DOX-HCL在注射部位肌肉中消除最快,半衰期为4.81 d,在肾脏和肌肉中消除最慢,半衰期均为6.08 d。对于FF,联合组和单一组中FF均在注射部位消除最快,半衰期分别为2.30 d和2.27 d;在肝脏中消除最慢,半衰期分别为3.92 d和3.85 d。对于FFA,联合组和单一组FFA均在注射部位消除最快,半衰期分别为3.85 d和3.63 d;在肝脏部位消除最慢,半衰期分别为5.87 d和5.41 d。采用WT1.4软件,以95%可信度计算三种药物在山羊的休药期。结果如下:联合组中FF在山羊中休药期建议值分别为肌肉（14.73 d）、肝脏（5.05 d）、肾脏（18.68 d）和注射部位肌肉（19.65 d）;单一组中FF在山羊中休药期建议值分别为肌肉（15.32 d）、肝脏（4.97 d）、肾脏（17.18 d）和注射部位肌肉（19.21 d）。DOX-HCL在山羊中休药期建议值分别为肝脏（30.54 d）、肾脏（27.75 d）、肌肉（28.11 d）和注射部位肌肉（38.41 d）。综上,FF按20 mg/kg b.w.,每48 h给药1次,颈部肌肉注射给药2次时,推荐休药期为20 d。当FF按20 mg/kg b.w.,每48 h给药1次,颈部肌肉注射给药2次,同时以10 mg/kg b.w.DOX-HCL,每24 h给药1次,给药3 d时,推荐休药期为39 d。