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雄甾-4-稀-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)是重要的甾体药物中间体。在前期研究中发现,AD、ADD积累量不同的两株新金分枝杆菌Mycobacterium neoaurum TCCC 11028(MNR)和 M.neoaurum TCCC 11028 M3(MNR M3)的3-甾酮-△1-脱氢酶(KsdD)基因存在单个碱基差异(C413T),导致KsdD酶的138位氨基酸变化(S138L)。本文采用大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中外源表达、基因敲除和基因置换的方法探究了 MNR和MNR M3的ksdD碱基差异导致的KsdD酶结构变化对KsdD酶活性的影响,并对分枝杆菌中KsdD酶的转录水平进行了分析,为KsdD酶的结构和催化机理研究提供基础数据和理论依据。对 KsdD 酶外源表达菌株 E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-ksdD-MNR和E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-ksdD-MNR M3 进行 AD 转化实验,检测发现E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-ksdD-MNR菌株的转化能力显著高于E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-ksdD-MNR M3菌株,与分枝杆菌出发菌株类似,初步证实ksdD基因中单个(413位)碱基差异导致的KsdD酶结构变化对KsdD酶活性有影响。利用双同源重组原理成功构建了 ksdD基因敲除菌株MNR M3△ksdD 和ksdD基因置换菌株MNR M3△ksdD::ksdD-MNR,工程菌株的植物甾醇转化实验表明MNR M3△ksdD菌株彻底失去了C1,2位脱氢能力,初始ADD/AD比例很低(0.15)的MNR M3菌株在ksdD-MNR M3被置换为ksdD-MNR之后,其ADD/AD比例达到了 31.54,提高了 210倍,这证实酶结构变化是影响MNR和MNR M3菌株中ADD/AD比例的关键因素,ksdD基因的413位碱基差异对KsdD酶活有重要影响。利用 Discovery Studio 2.5 软件,以红球菌Rhodococcus erythropolis SQ1 KsdD的晶体结构为模型推测分枝杆菌中KsdD酶残基突变导致酶活性变化的机理,结果显示Ser-138是活性中心位置的一个关键氨基酸残基,对维持KsdD酶活性中心的疏水环境有重要作用。通过qPCR对MNR和MNR M3中KsdD酶的转录水平进行了分析,发现MNR菌株的ksdD基因表达量为MNR M3菌株的71%,表明两株菌KsdD酶转录量处于同一水平,不是引起AD、ADD积累量变化的主要因素。