【摘 要】
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生物丁醇是一种能值高、腐蚀性低的生物燃料。以木质纤维素类生物质为原料生产丁醇,具有原料成本低、环境性能友好的天然优势。预处理是实现木质纤维素高效生物转化的关键步骤,而在此过程中产生的发酵抑制物是限制丁醇高效合成的瓶颈之一;其中由木质素衍生的酚类物质是对产溶剂梭菌抑制作用较强的一类化合物。此外,酚类物质水溶性差、种类繁多,使得对其定性定量分析较为困难;同时酚类物质在预处理过程中的衍生规律及其抑制丁醇
【基金项目】
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淮阴工学院研究生科技创新计划项目（编号HGYK202106）； 国家自然科学基金青年项目（编号21808075）；
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生物丁醇是一种能值高、腐蚀性低的生物燃料。以木质纤维素类生物质为原料生产丁醇,具有原料成本低、环境性能友好的天然优势。预处理是实现木质纤维素高效生物转化的关键步骤,而在此过程中产生的发酵抑制物是限制丁醇高效合成的瓶颈之一;其中由木质素衍生的酚类物质是对产溶剂梭菌抑制作用较强的一类化合物。此外,酚类物质水溶性差、种类繁多,使得对其定性定量分析较为困难;同时酚类物质在预处理过程中的衍生规律及其抑制丁醇发酵的机理尚不明确,导致利用木质纤维素生产丁醇缺乏理性指导。针对以上问题,本文选取玉米秸秆作为木质纤维素原料,以Clostridium acetobutylicum ATCC 824作为研究对象,揭示玉米秸秆酸预处理过程中酚类物质的衍生规律,并重点考察复合酚类物质胁迫对丁醇发酵的全局影响,进而阐明该类物质抑制丁醇发酵的分子机制。本文的主要研究结论如下:（1）研究了不同酚类物质与纤维素酶解之间的相互作用关系,并探究了不同酸预处理工艺对酚类物质浓度（CPhe）的影响。结果表明,随着预处理温度的升高,葡萄糖含量（CGlc）逐渐提高,预处理温度高于160℃,达到180～200℃的温度范围时,纤维素组分过度降解,产生较低含量的葡萄糖。此外,酚类物质在水解液中的浓度会发生变化,并且1g/L的酚类物质存在于水解液中时,即可降低酶解效果。（2）建立了可同时预测稀无机酸预处理后的水解液中CPhe和CGlc衍生特征的人工神经网络模型。结果表明,所建立的神经网络模型对CPhe和CGlc的预测具有良好的拟合性能（R2＞0.90）。计算了无机酸种类（kIA）、无机酸浓度（CIA）、预处理温度（T）、预处理时间（t）、原料固液比（RSL）、酶添加量（E）这6个输入变量对CPhe和CGlc影响的相对重要性。结果表明,预处理过程中的5个参数（CIA、T、t、RSL和kIA）对CGlc的影响度分别为23%、14%、12%、16%和14%,酶添加量（E）对CGlc的影响度达21%。此外,对CGlc和CPhe影响度最大的为无机酸浓度（CIA）,其影响度分别达到了 23%和22%。（3）研究了复合酚类物质对典型的产溶剂梭菌C.acetobutylicum ATCC 824 丁醇发酵的影响。发酵动力学数据表明,复合酚类胁迫12h后,菌株的葡萄糖利用速率与对照相比降低了 21.2%,最终产物丁醇浓度仅为6.4g/L的低水平。酚酸、酚醛和复合酚类胁迫下,发酵过程中C.acetobutylicum的胞内活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）水平分别与无胁迫批次相比提高了 1.04、2.40和1.68倍;结果表明复合酚类物质对C.acetobutylicum的溶剂合成的抑制作用强于酚酸,但弱于酚醛。（4）利用转录组学技术分析了复合酚类胁迫条件下细胞的关键生理过程的变化,结果表明,复合酚类胁迫影响细胞的膜转运蛋白、碳代谢、抗氧化活性等关键生理过程。所有产生差异表达的基因中,16个编码ABC转运蛋白的基因出现上调,10个基因下调,4个与谷胱甘肽代谢相关的基因产生差异表达,该路径中的关键基因trxA（硫氧化还原蛋白）和trxB（硫氧化还原蛋白还原酶）与对照批次相比上调了 1.92倍。此外,孢子生成、细胞分裂的相关基因也出现显著变化,编码细胞分裂蛋白的基因ftsA与对照批次相比下调了 2.11倍。综上所述,本论文的研究结果不仅为木质纤维素生物质的预处理工艺优化提供新的思路,也为通过代谢工程手段构建具有预处理衍生抑制剂高耐受能力的鲁棒性工程菌株提供理论指导。
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