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蛋白纯化技术广泛应用于医药、食品、化工等领域,其中亲和层析是有效的方法之一。其特点是易操作、纯化效率高。然而,亲和层析中需要在目的蛋白上引入亲和标签,通常,这些标签会影响蛋白质的功能,需要被蛋白酶去除,即耗时又昂贵。断裂内含肽包含空间结构上互不连续的两个片段N片段（IN）和C片段（IC）。其中IN和IC片段可分别作为亲和配体和标签,两者通过亲和吸附作用完成目的蛋白纯化构建的亲和纯化系统,不需要额外去除标签,有效避免了蛋白酶的使用,简化了蛋白纯化操作。因此,将断裂内含肽应用于蛋白纯化成为一种更优的选择。Consensus fast DnaE（Cfa DnaE）内含肽是一种新型的人工断裂内含肽,具有高效剪接活性及对环境的高耐受性。目前尚未在蛋白纯化领域中应用,本研究以该内含肽为研究对象,构建了一种基于Cfa DnaE内含肽的新型亲和纯化系统。具体研究内容如下:（1）为了建立基于Cfa DnaE内含肽的新型亲和纯化系统,本研究通过分子手段,将Cfa DnaE的IN片段中的全部半胱氨酸突变为丙氨酸,IN的羧基端引入组氨酸标签与一个半胱氨酸,分别用于IN片段的纯化及载体偶联;将IC片段和目的蛋白GFP相融合,用于蛋白的纯化。在IC-GFP的基础上,突变掉Asp136和Cys+1两个关键氨基酸,阻止了内含肽的断裂反应,用于测定介质的层析性能。本文成功构建得到了E.coli BL21（DE3）/pET30b-IN、E.coli BL21（DE3）/pTXB1-IC-GFP和E.coli BL21（DE3）/pTXB1-IC-GFP-D三株工程菌,分别用于介质制备、蛋白纯化和介质性能测定。（2）为了进一步优化纯化系统的表达和纯化条件,本文通过对E.coli BL21（DE3）/pET30b-IN和E.coli BL21（DE3）/pTXB1-IC-GFP的菌体浓度、诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度分别进行优化,优化结果显示,IN蛋白的最适表达条件为:菌体OD600为0.6时,加入0.2 mmol?L-1的IPTG浓度,18°C条件下诱导表达15 h;IC-GFP蛋白的最适表达条件为:菌体OD600为0.6时,加入0.4 mmol?L-1的IPTG浓度,18°C诱导表达15 h。进一步优化用于洗脱过程的咪唑浓度梯度,确认了IN蛋白的最优除杂、洗脱浓度分别为150、500 mmol?L-1;IC-GFP融合蛋白的最优除杂、洗脱浓度分别为250、500mmol?L-1。（3）为进一步揭示纯化系统中内含肽的断裂和抑制断裂条件,本文比较了pH、温度、DTT浓度、Zn2+浓度条件对IN和IC-GFP蛋白断裂速率的影响,结果显示,Cfa DnaE断裂内含肽在pH6-8之间无显著变化;在4°C-80°C条件下断裂效果却有显著差异,最佳的断裂和抑制断裂温度分别为37°C和4°C;在10-50 mmol?L-1的DTT浓度范围内加快断裂反应的速率,在10 mmol?L-1的DTT浓度下,10 min内断裂79%,在50 mmol?L-1的DTT浓度下,10 min断裂90%;在0.5-5 mmol?L-1的Zn2+浓度下会降低断裂速率,与空白对照相比,0.5 mmol?L-1Zn2+降低了31%,1 mmol?L-1Zn2+降低了47%。以断裂速率为指标,Cfa DnaE内含肽的最佳断裂条件为:pH7,温度37°C,DTT浓度50 mmol?L-1;最佳抑制断裂条件为:pH6,温度4°C,Zn2+浓度1 mmol?L-1。（4）Cfa DnaE内含肽介导的新型亲和纯化系统在GFP纯化中的应用。本研究将IN配体与活化的琼脂糖载体共价偶联,得到一种新型的IN亲和介质,并探索最佳再生条件。新介质在对GFP的纯化应用效果为:IC-GFP-D的饱和吸附量为66.48 mg?mL-1,动态载量为30 mg?mL-1,在0.1 mol?mL-11 NaOH条件下再生后的介质的动态载量为29.81 mg?mL-1,GFP蛋白的纯度为98.21%,回收率为29.33%。