目的:利用Lewis肺癌移植瘤小鼠模型,研究在肺腺癌发病进程中滤泡调节性T细胞(follicular regulatory T cells,Tfr)比例的变化,并分析其与疾病状态间的关系;在体外以Lewis肺癌细胞培养上清模拟肿瘤微环境,研究肿瘤微环境对Tfr细胞分化的影响,并探讨IL-6在此过程中发挥的作用。方法:(1)利用皮下注射Lewis肺癌细胞的方式构建肺癌移植瘤小鼠模型。在肺腺癌发病进程中,通过流式细胞术检测小鼠腹壁引流淋巴结和肿瘤组织中Treg细胞、Tfr细胞和Tfh细胞的比例,并分析Treg/Tfr细胞比值以及Tfh/Tfr细胞比值的变化情况。(2)免疫磁珠法分选正常小鼠脾脏来源的CD4+CD25+T细胞,与Lewis肺癌细胞进行transwell共培养,以CD4+CD25+T细胞单独培养作为对照。通过流式细胞术检测CD4+CD25+T细胞CXCR5和Bcl-6的表达情况,分析两种细胞间可能存在的作用方式。(3)用无血清RPMI 1640培养基分别将相同数量的鼠源性Lewis肺癌细胞、CT26结肠癌细胞以及MFC胃癌细胞在相同条件下进行培养。收集细胞培养上清,ELISA检测不同肿瘤细胞培养上清中IL-6的表达水平。(4)免疫磁珠法分选正常小鼠脾脏来源的CD4+CD25+T细胞,每孔加入1/4总体积的Lewis肺癌细胞培养上清。其中实验组Lewis肺癌细胞培养上清预先加入抗IL-6中和性抗体处理,用以抑制IL-6的生物学活性。对照组Lewis肺癌细胞培养上清不做任何预处理。培养72h后采用流式细胞术检测CD4+CD25+T细胞CXCR5和Bcl-6的表达情况(5)免疫磁珠法分选正常小鼠脾脏来源的CD4+CD25+T细胞,实验组加入rm IL-6(10ng/ml)。培养72h后采用流式细胞术检测CD4+CD25+T细胞CXCR5、Bcl-6以及Foxp3的表达情况。(6)肺癌移植瘤小鼠尾部静脉注射抗IL-6中和性抗体,以等体积PBS溶液作为对照,观察肿瘤生长情况。通过流式细胞术检测小鼠腹壁引流淋巴结和肿瘤组织中Treg和Tfr细胞的比例,分析Treg/Tfr细胞比值的变化情况。结果:(1)随着癌症的发展进程,荷瘤小鼠腹壁引流淋巴结中Tfr细胞的比例不断上升,且与野生型小鼠相比差异明显(P<0.01)。肿瘤组织中Tfr细胞比例在第14天时上升显著,与第7天相比差异有明显统计学意义(P<0.01),在第21天时细胞比例下降。荷瘤小鼠淋巴结和肿瘤组织中Treg/Tfr细胞比值较野生型小鼠均明显下降(P<0.01)。荷瘤小鼠淋巴结中Tfh/Tfr细胞比值较野生型小鼠下降(P<0.05)。该结果提示:肿瘤微环境可能促进Tfr细胞的分化,并且Tfh细胞与Tfr细胞比例失衡。(2)与对照组相比,CD4+CD25+T与Lewis肺癌细胞Transwell共培养组中CD4+CD25+T细胞CXCR5和Bcl-6的表达水平均出现明显上调。该结果提示:Lewis肺癌细胞可以通过间接作用的方式诱导CD4+CD25+T细胞表达CXCR5和Bcl-6,以促进CD4+CD25+T细胞向Tfr细胞分化。(3)Lewis肺癌细胞培养上清中IL-6的表达水平最高(276.3±29.9 pg/ml),而CT26细胞和MFC细胞培养上清中IL-6的表达水平分别仅为(77.38±13.86pg/ml)和(145.8±32.6 pg/ml)。该结果说明:Lewis肺癌细胞具备大量分泌IL-6的能力,即以Lewis肺癌细胞培养上清模拟的肿瘤微环境中存在着高水平IL-6。(4)抗IL-6中和性抗体处理组CD4+CD25+T细胞CXCR5的表达水平与对照组相比明显下降(P<0.01),而Bcl-6的表达则无明显变化。该结果提示:以Lewis肺癌细胞培养上清模拟的肿瘤微环境能够促进Tfr细胞分化,并且CXCR5表达的上调与细胞培养上清中高水平的IL-6有关。(5)加入rm IL-6(10ng/ml)实验组中CD4+CD25+T细胞CXCR5的表达水平与对照组相比明显增加(P<0.01),而Bcl-6和Foxp3的表达则无明显变化。该结果提示:IL-6能够促进CD4+CD25+T细胞上CXCR5的表达。(6)与PBS对照组相比,注射抗IL-6中和性抗体的荷瘤小鼠肿瘤生长速度减慢,淋巴结和脾脏肿大程度减轻。腹壁引流淋巴结和肿瘤组织中Tfr细胞比例下降(P<0.05),Treg/Tfr细胞比值增大(P<0.05)。该结果提示:肺癌移植瘤小鼠体内IL-6的缺失可能会影响Tfr细胞的分化。结论:(1)随着癌症的发展进程,荷瘤小鼠体内Tfr细胞的比例增加,Tfh细胞与Tfr细胞比例失衡。(2)肿瘤微环境促进CD4+CD25+T细胞向Tfr细胞分化。(3)IL-6促进CD4+CD25+T细胞CXCR5的表达。