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CUEDC2是一个功能尚不完全清楚的基因,位于人基因组10号染色体上,由9个外显子组成,它包含CUE结构域,该结构域是一个含约40个氨基酸残基的保守结构,广泛存在于真核细胞的蛋白质中,它能与泛素结合,既能识别单泛素也能识别多泛素,并能够促进分子内的单泛素化,含有CUE结构域的蛋白质在细胞内信号转导过程中也发挥一定的作用。CUEDC2能够和孕激素受体(PR)相互作用并抑制孕激素受体的活性,而且CUEDC2可以通过泛素蛋白酶体通路促进孕激素受体的降解,干涉CUEDC2后在孕激素刺激下孕激素受体降解减少;而孕激素受体在乳腺癌的发生发展过程中有很重要的作用,提示CUEDC2可能对乳腺癌的进程有一定的抑制作用(The EMBO Journal,2007)。进一步的研究显示,CUEDC2与IKK和蛋白磷酸酶1(PP1)存在同一复合体中,能够通过招募PP1抑制IKK的磷酸化和激活,从而抑制NF-κB的激活,提示CUEDC2可能在炎性反应过程中也有一定的作用(Nature Immunology,2008)。 由于CUEDC2可能有很重要的生物学功能,所以本项研究运用生物信息学的方法预测了CUEDC2可能的启动子区域和可能参与调控它的转录因子。用PCR的方法对预测的启动子区域进行扩增,获得300bp、600bp、1000bp和2000bp的DNA序列,经测序鉴定正确后将其与不含启动子的pEGFP1报告基因载体连接,转染HEK293T细胞,通过荧光显微镜观察,发现4个不同长度的DNA序列都能够驱动绿色荧光的表达,具有启动子活性。为了进一步验证克隆序列的启动子活性,我们把4个不同长度的DNA序列和萤火虫荧光素酶报告载体pGL3-Basic连接,转染HEK293T细胞后通过荧光素酶活性测定发现4个DNA序列都具有较强的启动子活性。我们选取一些转录因子和萤火虫荧光素酶报告载体共同转染细胞,发现NF-κB2/p52能够很强的抑制CUEDC2启动子的转录活性,并且在过表达p52的HEK293T细胞中,CUEDC2的mRNA量和内源CUEDC2蛋白量都减少,进一步证实了p52是CUEDC2基因的转录抑制子。NF-κB1/p50也能抑制CUEDC2启动子的转录活性,但抑制效果不如p52强,NF-κB另外一个亚基 p65/RelA对CUEDC2启动子的转录活性没有影响。其它的转录因子如HSF、C-jun和IRF3等对CUEDC2启动子的转录活性几乎没有影响。为了更准确的定位启动子的活性区域,我们对CUEDC2启动子p600做了不同长度的截短,发现CUEDC2启动子p600的活性区域在它的3’端。为了找到和启动子p600结合的蛋白,我们把链霉亲和素磁珠和CUEDC2启动子p600偶联,和HEK293T细胞核提取物孵育,经SDS-PAGE分离后银染,实验组和对照组比较有一条有差异的银染条带。 为了进一步研究CUEDC2的功能,我们构建了CUEDC2条件打靶载体和非条件打靶载体,为了筛选中靶细胞,针对打靶载体设计并验证了Southern印记杂交用的探针。打靶载体电转小鼠ES细胞后,通过正负筛选标记筛选和Southern印记杂交的鉴定,我们鉴定出一株可能的中靶细胞,目前正在验证该株细胞是否正确。希望能够通过条件打靶获得CUEDC2基因敲除小鼠,从而进一步研究CUEDC2在动物体内的生物学功能。