调节转运蛋白AtNRT1.1、AtNRT2.1及PdAMT1.1基因表达对拟南芥和杨树氮素吸收的影响研究

来源 :北京林业大学 | 被引量 : 11次 | 上传用户:cxx163252
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氮素营养是调节植物生长发育的主要外界环境因子之一。而硝酸盐(NO3-)和铵盐(NH4+)是植物根部从土壤中吸收和利用氮素的两种主要的稳定形态的氮源。目前研究证明,植物对NH4+、N03的吸收利用受氮素转运蛋白家族中的多个基因调控。其中,NRT1.1、NRT2.1是NO3-转运系统中的关键基因,而AMT1.1基因是NH4+转运系统中的关键基因。通过调节这些关键转运基因的表达可以提高植物氮素吸收效率。本研究分别以乙烯调节、生长素调节及转基因技术这三种手段来调节氮素转运蛋白AtNRT2.1、AtNRT1.1和PdAMT1.1基因的表达水平,从而来影响拟南芥和杨树的氮素营养吸收效率。在乙烯调节方面,作者运用气相色谱法、扫描离子选择电极法(SIET)、实时荧光定量法(qRT-PCR)、GUS染色法等技术来检测拟南芥AtNRT2.1基因在NO3-吸收途径与乙烯合成及信号转导通路的互作网络中的地位。结果发现:拟南芥(Col-0)植株在低NO3-浓度(LN)处理下乙烯合成量有显著增加,并且乙烯信号通路中的关键因子CTR1、 EIN3和EIL1基因表达量受到调节,在乙烯报告基因株系Col-0/EBS:GUS、 ein3-leil1-1/EBS:GUS和ctr1-1/EBS:GUS中的EBS:GUS活性均有显著增加。LN处理可以诱导AtNRT2.1基因表达,从而增加高亲和的NO3-吸收速率。通过对比NO3-转运蛋白突变体nrt1.1、nrt2.1与Col-0株系中的乙烯合成量及EBS:GUS活性差异,证实了LN处理诱导的AtNRT2.1基因上调可以促进乙烯合成、增强乙烯信号通路强度;同时,乙烯又可负调控AtNRT2.1基因表达,降低高亲和的NO3-吸收速率。综上所述,我们揭示了在LN处理下,AtNRT2.1基因表达与乙烯合成及信号转导途径间存在一个负反馈调节环,这样在外界NO3-缺乏胁迫下的NO3-吸收就可以达到一个内部相对平衡的状态。在生长素调节方面,为研究生长素信号对植物NO3-营养吸收的调控作用,作者采用SIET技术和qRT-PCR技术,测定拟南芥野生型Col-0、生长素过表达突变体yuc1-D以及生长素通路缺失突变体axr1-12三种株系初始根中NO3-吸收速率以及AtNRT1.1基因表达量的差异;并进一步检测Col-0株系以及NO3-转运蛋白突变体nrt1.1株系在正常条件(CK)或施加外源IAA及生长素极性运输抑制剂2,3,5-三碘苯甲酸(TIBA)处理下的NO3-流速和AtNRT1.1基因表达量的差异。结果表明yuc1-D株系的N03-吸收速率以及AtNRT1.1基因表达量相比Col-0株系均有大幅增加,而axr1=12株系的N03-吸收速率以及AtNRT1.1基因表达量相比Col-0株系显著降低;在Col-0株系中施加外源IAA对N03-吸收速率以及AtNRT1.1基因表达量有明显促进作用,而施加TIBA的效果反之,说明生长素对硝酸盐吸收有增强效应。而nrtl.1株系在CK、IAA.TIBA处理下N03-吸收速率差异较Col-0株系不明显,揭示了AtNRT1.1基因在生长素促进N03-吸收的调控途径中所起的重要作用。在转基因方面,作者从欧美杨NE-19中筛选并克隆了高亲和NH4+转运蛋白家族中的关键基因PdAMT1.1。经测序及蛋白结构分析发现,该基因片段大小为1,495bp,共编码498个氨基酸,包含9个跨膜蛋白结构域和1个保守结构域。组织特异性分析表明PdAMT1.1在根中的表达量要明显高于于芽、叶及茎中的表达量。通过亚细胞定位分析表明其定位于膜系统中。在模式植物拟南芥中过表达PdAMT1.1基因,发现在氮缺乏条件下,转基因株系OxPdAMT1.1的叶而积、株高等生理表型及NH4+吸收效率要明显高于其它株系,突变体amt1.1的表型及NH4+吸收效率最弱,而突变体回补株系amt1.1/PdAMT1.1的表型及NH4+吸收功能基本与Col-0及转空载体Col-O/V株系持平。从而验证了PdAMT1.1基因在促进植物生长、提高NH4+吸收效率方面发挥重要作用。然后我们通过叶盘侵染法进一步将PdAMT1.1基因转化进三倍体毛白杨中。通过氯酚红法检测、GUS检测、PCR检测等一系列手段,验证已获得6个转PdAMT1.1基因株系及3个转空载体株系。对缺氮处理下三倍体毛白杨的野生型WT、转空载体WT/V及过表达株系OxPdAMT1.1进行表型和功能分析,结果证明过表达株系OxPdAMT1.1表型及NH4+吸收效率均明显优于WT和WT/V株系。从而验证了通过转基因手段使得PdAMT1.1基因超量表达,可以获得能高效吸收利用氮素营养的杨树新品种。
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