背景毛囊是由上皮部分和真皮部分组成,这两种成分的细胞的相互作用在毛囊的形成与生长中发挥着重要的作用。毛囊的上皮细胞与真皮细胞之间的复杂的交流与作用被认为是促进毛囊再生及维持毛囊正常发育生长的关键因素。虽然毛囊的形成涉及到这两种细胞发出的一系列复杂并相互影响的信号,但一般来说,真皮部分的细胞被认为是引导者,而毛囊上皮细胞被认为是应答者。毛囊上皮部分包括外根鞘、内根鞘、毛母质和毛干,这些上皮成分均由位于毛囊隆凸部位的上皮干细胞产生。毛母质内的角质形成细胞被称为是“毛干的生长工厂”,这些角质细胞具有短暂快速增殖的能力,它们受毛囊内真皮乳头细胞释放的一系列信号因子的刺激,可快速增殖并分化为毛干等结构。毛囊真皮部分又被分为真皮乳头和真皮鞘。真皮乳头位于毛囊的底部,与周围的毛母质上皮部分相邻,被真皮鞘环绕包裹,仅通过基底的茎突与真皮鞘相连。真皮乳头内储存有大量毛乳头细胞,真皮乳头细胞分泌一系列细胞因子来影响与其相邻毛母质内角质上皮细胞的增殖及分化,继而影响毛囊生长并调控毛囊的生长周期。因此真皮乳头细胞在毛囊的生长中发挥着核心的调控作用。由于真皮乳头细胞的毛发诱导能力对于毛囊再生与生长至关重要,因此模拟细胞外环境以保留甚至恢复真皮乳头细胞诱导能力的模型日益得到人们的重视,这些模型主要分为体内毛囊重建模型和体外毛囊培养模型。体内动物模型又包括注射法、小室法和皮瓣法,总的原理是将真皮乳头细胞和上皮干细胞相混合,再用不同方法移植入裸鼠体内,观察体内毛囊重建与生长情况,从而模仿了真皮乳头细胞诱导毛囊再生所需的体内环境。但无论是注射法、小室法和皮瓣法均有各自的缺陷,使真皮乳头细胞的诱导能力受到了一定程度的损害并继而影响毛囊的重建。小室法是在裸鼠背部创造一个肉芽创面,然后将乳鼠上皮细胞与真皮细胞的混合物放入该创面上,大约在23天后可明显看到毛干长出,毛发质量和密度与正常无异常。虽然小室法产生的毛囊形态最佳,但是这种模型耗费的细胞数量最多,而且操作相对复杂。皮瓣法能产生与小室法类似的毛发效果,如毛干质量与密度,但是最早至少需要29天才能产生毛囊,这种方法需要的细胞量比小室法要少,但是需要行两次外科手术治疗,动物失血较多。注射法产生数量最少的毛发,这是因为,不像前两种方法,小室法将细胞混合物被放入解剖位置不正常的部位,即真皮致密层,形成大小不等的囊状物,这些囊状物容易破裂并导致排斥反应,大多数最终纤维化,很少有毛发长出。尽管如此,这种方法的优点在于它需要的细胞量最少,并且省力省时,容易快速产生少量毛囊。体内模型虽然可在体内原位研究毛囊,并且可用具体形态观察、免疫组织化学、来观察毛囊变化,但是难以对单个毛囊的体外坏境予以精确控制,从而难以准确阐述单个细胞因子在毛囊生长中所起的作用。细胞培养包括分离和培养单种细胞群,使细胞的形态、生化和分子参数可以被测量,然而细胞培养导致毛囊组织三维立体结构的丧失,使细胞培养不能准确地反映出整个器官的真实情况。毛囊器官培养弥补了细胞培养的缺点,同时保留了组织的完整结构。完整毛囊的器官培养能最大限度地模仿毛囊真皮乳头细胞的生态坏境及真皮乳头立体结构,从而在一定程度上保留了真皮乳头细胞的诱导能力。利用毛囊器官培养模型,我们可以准确检测外界不同药物或生长因子对真皮乳头细胞的影响。但目前毛囊器官培养所需的培养基尚不能完全模仿体内环境,与传统细胞培养相比,虽然器官培养的毛囊内真皮乳头细胞的毛发诱导能力得到了一定程度的保留,但仍然在培养中不断丧失,影响了毛囊的生长。本研究拟从两方面进行研究,一是改良将真皮乳头细胞移植入动物体内的实验模型,从而为真皮乳头细胞尽可能提供良好的体内环境,以促进毛囊的重建与生长；二是改良毛囊体外培养所需的环境,即培养基,使毛囊内的真皮乳头细胞的毛发诱导能力尽可能得到保留。该研究结果对于毛发体内再生重建和治疗各类毛发生长缺陷性疾病提供了重要的理论和临床实际意义。目的1设计一种更简便、更有效的动物模型,使移植入动物体内的真皮乳头细胞的诱导能力得到最大限度的保留,从而促进体内毛囊重建。2改良毛囊器官培养的外坏境,即培养基,以恢复毛囊真皮乳头细胞的部分诱导能力,从而使体外培养的毛囊的增殖期延长。方法1.裸鼠体内毛囊重建模型的改良1.1毛囊上皮组织与毛囊真皮细胞的制备：将出生24小时内的C57BL/6J小鼠处死,用75%酒精浸泡消毒后取其背部全层皮肤,然后用PBS液反复润洗,去除多余脂肪,放入含1%中性蛋白酶的DMEM消化液中,在4℃下消化过夜。次日将已消化过夜的皮肤取出,用镊子可轻易分离上皮与真皮组织。将完整的上皮片临时放入含10%小牛血清的Dulbecco’s modifiedEagle’s medium(DMEM)培养液(DMEM/10)的培养皿中待用。用显微剪反复地将真皮组织剪成细小颗粒状,然后放入0.2%胶原酶中在37℃下消化1小时。消化结束后,加入等量的DMEM/10,然后依次用100微米和40微米的细胞滤网过滤,将所得的细胞悬液在200g下离心5分钟,再将细胞沉淀块重新悬浮于1毫升的DMEM/10液体中并计数。最后再次将细胞悬液离心并悬浮于20微升的DMEM/10中,使成泥浆状。1.2设计改良皮瓣法动物模型：将1.5毫升离心管盖子取下,修剪成一个约1.5cm2大小的圆形硅胶板。将制备的上皮片角质层覆盖在硅胶板的光滑面,使真皮面朝上。用微型吸管将泥浆样的真皮悬液涂抹于上皮片的真皮面。将载有上皮片及真皮细胞的硅胶板放于37-℃的CO2孵箱中,蒸发掉多余的水分。将4-5周大的裸鼠腹腔内注射1%戊巴比妥液麻醉,背部用0.5%聚维酮碘液消毒。在背部近臀部设计一切口线,切开皮肤潜行分离皮下,使行成一个能容纳假体的空间,将载有上皮片及真皮细胞的硅胶板移植入已分离的皮下,再将切口缝合。1.3为进行对比,我们同时进行了传统皮瓣法的实验模型,在裸鼠背部行三边切口(约0.8×1 cm),掀起整个皮肤层,植入一个载有上皮片及真皮细胞的薄层软硅胶片(约2.5×.5 cm),上皮片的真皮面同样朝上,其余步骤同改良皮瓣法。1.4打开皮瓣观察毛发生长情况：当背部皮肤明显隆起并且颜色变黑时,我们设计三边切口,切开皮肤打开皮瓣,向后翻转使其暴露在外界环境中,再拉拢周围的切口并间断缝合以闭合创面。1.5移植细胞的追踪： 为评估移植入裸鼠体内的上皮细胞,我们选择用GFP转基因的C57BL/6J小鼠的背部上皮细胞片。为追踪真皮细胞,我们用dilinoleyltetramethylindocarbocyanine perchlorate (Dil),一种橙红色细胞膜荧光染料,来对真皮细胞进行染色,再将其移植入裸鼠体内。GFP上皮片与普通乳鼠真皮细胞混合后移植,Dil染色的真皮细胞与普通乳鼠来源的上皮细胞片混合移植。1.6毛发生长的评估：毛发生长的评估分别通过外观和组织学(HE染色石蜡切片及电镜检查)来观察。2.毛囊器官培养液的改良—溶菌酶在毛囊中的表达及对毛囊体外生长的影响2.1毛囊生长周期中的溶菌酶表达变化：分别将处于增殖期和衰退期的毛囊用4%多聚甲醛固定,然后用石蜡包埋、切片(厚度4gm),抗原还原处理后,分别用溶菌酶一抗(兔来源抗鼠,货号：SAB 1306215,1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)和相应第二抗体处理组织切片。然后DAB加苏木精染色显色。2.2毛囊体外培养：选择4-5周大的C57BL/6J小鼠,从其触须垫部位显微分离出触须毛囊,从中选择处于增殖期的毛囊并将其放入24孔细胞培养板中进行培养,培养基包括500μ1 Williams E培养液,浓度为2 mM L-谷氨酰胺,10 mg/ml的胰岛素,10g/ml的氢化可的松和经稀释100倍的青霉素与链霉素双抗液。每次试验将40根毛囊平均分成4组,分别加入溶菌酶1,5,10 μg/ml或者不加溶菌酶。试验共重复3次。2.3毛囊的毛干增加长度与生长周期的测量：我们使用倒置显微镜(IX71；Olympus Optical Co.Ltd, Tokyo,Japan)分别在第0,1和3天拍照,观察毛囊生长周期的变化。2.4 Ki-67 and 5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU)双荧光染色：为了追踪毛囊内上皮干细胞的增殖情况,我们在毛囊体外培养结束前12小时在培养基中加入10 μM的BrdU。培养结束后我们挑选出仍处于增殖期的毛囊,放入4%多聚甲醛中固定24小时,石蜡包埋,切成4μm厚的薄片,经抗原修复后,在4℃下用抗BrdU和Ki-67的混合一抗(兔抗小鼠Ki-67,货号：AB9260,1:1000;Millipore, Bedford, MA,USA和大鼠抗小鼠BrdU,货号：ab6326,1:100;Abcam, Cambridge, MA,USA)孵育组织切片。接下来用相应荧光二抗处理组织切片。细胞核再用4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)复染。2.5毛乳头细胞培养：毛乳头从C57BL/6J鼠触须毛囊的毛球部分离获得,再将毛乳头放入含4型胶原酶的培养皿中消化3小时,然后放入含100 U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和20%小牛血清的DMEM中,在37℃、5% CO2条件下培养。取出的毛乳头共培养5天,每3天换一次培养液。当细胞在培养皿中生长接近至融合状态时,将其以1：3的比例进行传代。获得的毛乳头细胞暂放入DMEM/10液中等待下一步使用。2.6蛋白免疫印迹法：将培养2代的毛乳头细胞用5和10μg/ml的溶菌酶处理24小时,然后用RIPA裂解液提取所有蛋白,然后使用10%SDS-PAGE将蛋白转移至聚偏氟乙烯膜上,将膜分别用一抗在4℃下孵育过夜。一抗包括：兔抗小鼠LEF1,货号：ab85052,1:400;Abcam).兔抗小鼠碱性磷酸酶(ALP),货号：sc-30203,1:1000;SantaCruz Biotechnology),和兔抗小鼠β-actin(ab8227, 1:1000;Abcam)。然后将膜用对应的二抗在室温下孵育1小时。免疫复合物用免疫印迹增强化学发光试剂盒检测。实验重复3次,用Image-Pro Plus 6.0软件(Media Cybernetics,Silver Spring, MD, USA)对条带光密度值进行分析。3.统计学分析应用SPSS 19.0软件进行统计分析,所有数据用均数±标准误表示(x±SEM)。对于动物体内实验,两组间数据比较采用unpaired t-test。对于毛囊器官培养的数据分析,多组之间的数据比较采用One-Way ANOVA分析,先检验方差是否相齐,若方差相齐,两两比较用Bonferroni test分析,方差不齐则应用welch分析。P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.与传统皮瓣法相比,经过我们改良的皮瓣法操作步骤更为简化,动物在术中失血更少,术后不仅能产生正常形态和密度的毛发,而且能明显缩短真皮乳头细胞在体内诱导毛囊重建所需的时间。2.我们发现溶菌酶主要表达在增殖期毛囊的真皮部位(真皮乳头和真皮鞘),而在衰退期的表达明显减弱,不仅如此,在器官培养液中加入适量的溶菌酶,能明显恢复真皮乳头细胞的毛发诱导能力,从而延长毛囊的增殖期,促进毛囊毛干的生长。结论1.本研究通过改良皮瓣法模型,改善了移植入体内的真皮乳头细胞的生长环境,提高了其毛发诱导能力,使毛发的形成时间大大缩短。2.我们发现溶菌酶具有促进毛囊在体外生长的能力。3.我们发现溶菌酶可恢复培养的真皮乳头细胞的部分毛发诱导性,从而促进毛囊在体外的生长。