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研究背景:急性淋巴细胞白血病(AcuteLymphoblastic Leukemia,ALL),是一种以骨髓、外周血和其他器官中未成熟淋巴细胞的异常增殖为特点的恶性克隆性疾病,成人ALL具有长期预后差、复发后生存率低的特点。在ALL的发病机制中,遗传学改变发挥了关键作用,探索ALL的遗传学特点不仅有助于明确发病机制,更有助于指导临床治疗。既往研究报道PTKs和PTPs的基因突变或表达量异常导致信号通路分子异常的磷酸化或去磷酸化过程,导致细胞的增殖增加、分化异常或凋亡改变从而在ALL的发生发展中发挥重要作用。PTPN21基因编码蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型21,以往报道其在肿瘤组织中高表达并参与肿瘤细胞的生长,但PTPN21基因是否在ALL中异常高表达尚不明确,PTPN21基因在ALL中发挥何种作用尚有待研究。本研究通过检测ALL患者骨髓标本发现PTPN21基因的异常高表达,进一步通过慢病毒感染在ALL的细胞株中过表达PTPN21基因或利用CRISPR-Cas9技术敲除PTPN21基因,检测PTPN21表达量的改变对细胞的凋亡、增殖周期以及耐药的影响,并探索相关机制。第一章PTPN21基因的过表达在急性淋巴细胞白血病的增殖周期和耐药中的作用及机制研究目的:研究PTPN21基因在急性淋巴细胞白血病中的作用,探索PTPN21是否参与细胞的增殖周期的调控和耐药的发生,阐明相关机制。方法:通过荧光定量PCR检测ALL患者和对照组骨髓标本中的PTPN21基因的mRNA水平;慢病毒感染的方法在ALL细胞株:Jurkat、NALM-6和Reh细胞中过表达PTPN21基因;Western blotting和免疫荧光鉴定PTPN21蛋白的过表达和检测质粒转染的效率;流式细胞术检测ALL细胞过表达组和对照组的凋亡和增殖周期;Western blotting检测Src和MAPK通路的磷酸化水平;MAPK通路小分子抑制剂实验验证相关通路的作用;柔红霉素处理过表达组和对照组细胞并通过流式细胞术检测凋亡来研究ALL细胞的耐药;数字基因表达谱测序筛选差异表达基因,荧光定量PCR验证,探索耐药相关机制。结果:ALL患者中PTPN21基因的mRNA水平异常增高,并且初诊和复发的患者中PTPN21基因显著高表达,而完全缓解的患者PTPN21基因的mRNA水平与对照组无显著性差异;在Jurkat、NALM-6和Reh细胞中,过表达PTPN21基因不影响细胞的凋亡,过表达组的GO期细胞比例均显著性低于对照组,而S/G2/M期细胞比例则显著性高于对照组,两组的G1期细胞比例无显著性差异,表明PTPN21基因的过表达促进了Jurkat、NALM-6和Reh细胞的增殖;Jurkat细胞中过表达组的Src的磷酸化水平明显减弱,ERK1/2和JNK的磷酸化水平明显增强,p38的磷酸化水平无明显变化;NALM-6细胞过表达组的Src的磷酸化水平明显减弱,ERK1/2和p38的磷酸化水平明显增强,JNK的磷酸化水平无显著性变化;Reh细胞过表达组的Src的磷酸化水平明显减弱,ERK1/2、p38和JNK的磷酸化水平均明显增强;ERK1/2通路抑制剂PD98059并不影响PTPN21的促进ALL细胞增殖的作用;JNK通路抑制剂SP600125能有效逆转PTPN21的促进Jurkat细胞增殖的作用,但不能逆转PTPN21的促进Reh细胞增殖的作用;p38通路抑制剂SB203580能有效逆转PTPN21的促进NALM-6细胞增殖的作用,并且能部分逆转PTPN21的促进Reh细胞增殖的作用;PTPN21基因抑制了Jurkat和NALM-6细胞对柔红霉素的敏感性;数字基因表达谱测序初步筛选,荧光定量PCR验证发现IL22RA1基因的mRNA水平上调。结论:PTPN21基因的异常高表达可能参与了ALL的发病和复发;PTPN21可能通过去磷酸化Src激活其激酶活性,进一步激活下游MAPK通路,从而促进了 ALL细胞的增殖;参与PTPN21调控细胞增殖的MAPK通路可能在不同来源细胞中通路不同:JNK通路和p38通路可能分别是Jurkat细胞和NALM-6细胞中发挥作用的关键通路;p38通路可能还部分参与了PTPN21基因促Reh细胞增殖的作用;PTPN21基因可能参与ALL细胞对柔红霉素的耐药,经筛选验证发现IL22RA1基因的表达上调可能参与PTPN21介导的耐药。第二章应用CRISPR-Cas9技术在急性淋巴细胞白血病细胞株Jurkat中敲除PTPN21基因对增殖周期的调控作用目的:通过CRISPR-Cas9技术建立敲除Jurkat细胞的PTPN21基因的细胞系,研究敲除PTPN21基因是否抑制ALL细胞的增殖。方法:选择Zhanglab MIT的CRISPR Design tool针对2号外显子和13号外显子分别进行gRNA的设计;以pX458质粒作为gRNA的表达载体;以293T细胞作为目的细胞,利用T7E1实验进行不同gRNA的剪切效率检测;以核转方式在Jurkat细胞中表达Cas9质粒;流式细胞分选仪分选GFP表达阳性的细胞;极限稀释法进行细胞单克隆的筛选,提取克隆的基因组DNA,PCR扩增后测序;针对出现双信号峰的克隆,利用TA克隆进一步测序明确;利用流式细胞术检测筛选获得的克隆的凋亡和增殖周期。结果:通过T7E1实验选择分别针对2号外显子和13号外显子剪切效率最高的两条gRNA进行Cas9质粒的构建;通过测序筛选共获得5个单等位基因突变和6个双等位基因突变的克隆,建立了 Jurkat细胞敲除PTPN21基因的细胞系;敲除PTPN21基因后不影响Jurkat细胞的凋亡;敲除PTPN21基因后Jurkat细胞的S/G2/M期比例显著性低于对照组,表明敲除PTPN21基因抑制了 Jurkat细胞的增殖。结论:建立了Jurkat细胞敲除PTPN21基因的细胞系,敲除PTPN21基因后Jurkat细胞的增殖被抑制。