微生物在自然界中有着丰富的多样性。但自然界中绝大多数微生物处于未培养状态,尤其是海洋微生物。尽管可以通过免培养的宏基因组等方式来探究大部分未培养成员,却无法通过基于培养的方式对这些微生物进行系统的研究,严重限制了我们对其生理特征、生态功能及天然活性产物的了解。因此,获得尚未培养微生物的纯培养菌株,具有重要的科学意义和深远的应用前景。自然界中大部分微生物难以被纯培养的关键限制性因素之一为在原始生境中不同微生物之间往往存在相互依赖的共生或互作关系,而在实验室条件下却又难以模拟微生物细胞间的共生关系及在此互作过程中细胞所释放的各种代谢产物及其中间体、信号分子、小分子化合物和酶等。而基于共培养策略的微生物培养方法则被认为是克服该问题的有效方法。但目前关于共培养方法的研究较少,且现有方法仍存在很多不足,例如高偶然性、无法大批量筛选共培养菌株、操作复杂和目标菌株纯化困难等。因此,亟需开发一种新型共培养技术来克服微生物的培养障碍。本研究针对这一问题开展了系统的研究,取得如下结果:1.基于微生物共生关系中的偏利共生,本研究设计了一种简便、高效、易操作且可大量分离未培养微生物的新型共培养技术—夹心平板法（sandwich agar plate method）。该技术整合了传统的分离方法和共培养策略,以稀有物种在微生物群落中的重要生态功能作为理论基础,选择生态环境中可培养的稀有微生物物种作为助长菌（“helper”菌株）以共培养其它的海洋微生物。在研究中将有细胞活性的可培养助长菌加入并固定在双层培养基中层,在上层培养基上面进行共培养微生物的分离培养。该夹层复合培养基不仅具备传统分离方法的直观、简便、易操作和技术难度低等优点,同时还能够实现助长菌与目标分离物的物理隔离,解决了目标菌株纯化困难的技术难题。2.选择了 8种海洋细菌作为助长菌将夹心平板技术应用于威海近海沉积物细菌资源的分离。经实验验证,该夹心平板技术的设计是成功的,对未培养微生物的分离培养培养是有效的。为了验证夹心平板技术在未培养海洋微生物分离培养中的有效性,我们选择了 8个海洋生境的稀有物种,包括噬果胶海藻杆菌（Algibacterpectinivorans）、居海绵华美菌（Formosa spongicola）、黏液黏液盐懒惰菌（Salipigermucosus）、大海栖滤膜菌（Cribrihabitans marinus）、北部湾玫瑰色小杆菌（Roseibacterium beibuensis）、河口科尔韦尔氏菌（Colwelliaaestuarii）、厦门希瓦氏菌(Shewanella xiamenensis和栖藻海杆菌（Marinobacter algicola）作为助长菌将夹心平板技术应用于威海近海沉积物细菌资源的分离。研究共获得825个物种,相比于无助长菌的对照培养基,8种夹心平板获得的细菌多样性是对照组的5倍;其中潜在新物种383个,是对照组的8.5倍,表明夹心平板法在未培养微生物的分离培养方面具有较大潜力。另外,利用16S rRNA基因扩增子测序技术对不同夹心平板和对照培养基中所有可培养细菌的群落组成进行分析,结果显示助长菌的加入可显著影响可培养细菌群落结构,不同助长菌的夹心平板均有其独特的细菌群落组成。3.对317株互作分离的新菌株与助长菌进行共培养实验,证实了助长菌对分离的共培养菌株具有真实有效的促生作用。为了探究共培养过程中助长菌对分离菌株促生作用的真实性和有效性,我们对317株互作分离的新菌株分别与助长菌进行了共培养实验。结果显示,超过50%的新菌株可被助长菌促生,其在纯培养条件下生长速度较慢或无法生长,而与助长菌共培养则可显著促进其生长,表明利用夹心平板技术可以获得某些依赖于共生才可生长的微生物的纯培养。4.对芽胞杆菌科和黄杆菌科中部分被促生菌株的促生机制行了分析,发现助长菌所分泌的小分子化合物可以显著促进芽胞杆菌科中互作依赖型细菌的生长;3株黄杆菌科被促生菌株所需的促生因子为血红素。通过探究芽胞杆菌科和黄杆菌科中部分分离菌株的被促生机制,发现助长菌厦门希瓦氏菌（Shewanella xiamenensis）和河口科尔韦尔氏菌（Colwellia aestuarii）所分泌的小分子化合物可以显著促进芽胞杆菌科中互作依赖型细菌的生长。同时,以3株黄杆菌科细菌的被促生现象为例,联合细胞培养和比较基因组学分析,发现其所需的促生因子为血红素,与助长菌河口科尔韦尔氏菌（Colwelliaaestuarii）的互作机制可能为助长菌为其提供了含血红素的蛋白质（主要为细胞色素）。本研究首次报道了在非宿主环境中,血红素可能为未培养微生物的重要促生因子,同时表明血红素不仅在病原微生物与宿主互作中扮演着关键角色,在非宿主环境中的微生物细胞间互作也起着重要作用。5.对113株被促生细菌的基因组进行了分析,结果表明被促生菌株中重要代谢物合成途径都有不同程度的缺失,这可能是未培养微生物的共性;对3株助长菌所分泌的小分子代谢物的分析表明,这些代谢物大多为微生物生长所必须的物质。为了更深入地了解夹心平板中助长菌的重要性,我们对113株被促生细菌的基因组和3株助长菌细菌所分泌的小分子代谢物进行了分析。基因组分析结果显示被促生菌株中重要代谢物合成途径（如脂肪酸、核苷酸、氨基酸、辅因子和维生素合成等）都有不同程度的缺失,推测“黑皇后假说”所表述的基因组趋简性可能是限制微生物纯培养的重要因素,助长菌的加入可能会为其提供所需的促生因子;另外,利用antiSMASH预测被促生菌株的次级代谢产物基因簇,结果显示超过96%的菌株可能存在多种次级代谢产物基因簇,表明夹心平板不仅可以应用于微生物资源的挖掘,还可应用于新型活性物质的发现。通过分析3株助长菌所分泌的小分子代谢物,发现相关化合物大多为一些微生物生长所必需的物质,如已知的生长促生因子或复杂的有机碳氮源等。结果表明助长菌可为其它微生物提供种类丰富的可利用底物和生长因子,也充分说明夹心平板培养策略是一种有效的共培养方法,其在未来的微生物资源挖掘中具有广阔应用前景。